短期凍存兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對其生物特性的影響＊

武成聰，李 強(qiáng)，陳佳濱，茹 嘉，蔡偉良，寧寅寬

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科二病區(qū)，廣西桂林541000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是組織工程中重要的種子細(xì)胞之一，大量具有良好分化能力的干細(xì)胞經(jīng)多次傳代后老化、分化能力下降或者死亡［1］。將良好分化能力BMSCs凍存則可在需要時及時復(fù)蘇應(yīng)用。而凍存復(fù)蘇過程是否會對BMSCs生物特性、骨化潛能造成影響。本實驗旨在探討短期凍存兔BMSCs對其生物特征及其成骨分化能力的影響，為后期組織工程骨構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級新西蘭白兔3只，1月齡，體質(zhì)量約0.5 kg，購于桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，實驗過程符合動物倫理學(xué)要求［2］。

1.2 主要試劑 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Hyclone公司；MTT、維生素C、β－磷酸甘油、地塞米松購于韓國BIOSHARP公司；小鼠抗兔CD44／CD45單克隆抗體、小鼠抗兔IgG1、PerCP生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H＋L）分別購于美國 ANTIGENIX、eBioscience、Jackson ImmunoResearch公司；小鼠抗兔CollagenⅠ購于武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗小鼠IgG／辣根酶標(biāo)記、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司；茜素紅購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸酶（ALP）測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分離、凍存 無菌條件下穿刺股骨大轉(zhuǎn)子抽取骨髓、分離，界面層細(xì)胞以含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。48h后首次換液，細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右傳代。第5代加入凍存保護(hù)液，程序降溫后液氮保存。30d后復(fù)蘇培養(yǎng)，凍存后第10代BMSCs作為實驗組；凍存期間再次分離原代細(xì)胞第10代BMSCs作為對照組。

1.3.2 MTT比色法測定吸光度（OD） 實驗組、對照組各以2.5×103個／孔BMSCs接種96孔板，每組8個復(fù)制孔，按MTT檢測流程操作，波長490nm下測定OD值，連續(xù)檢測7 d，每天OD均值代表細(xì)胞增殖情況。

1.3.3 細(xì)胞周期檢測 隨機(jī)收集實驗組、對照組各3皿細(xì)胞固定，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。重復(fù)3次，得出細(xì)胞各周期的百分率并計算增殖指數(shù)（PI）＝（S＋G2M）／（G0／1＋S＋G2M）。

1.3.4 BMSCs表型檢測 選取實驗組、對照組每組各3皿細(xì)胞，設(shè)空白管、同型對照管、實驗管，按操作說明分別標(biāo)記CD44／45－PerCP，流式細(xì)胞儀檢測。重復(fù)3次，各組陽性率做統(tǒng)計分析。

1.3.5 成骨分化檢測 實驗組和對照組各以105個／孔接種6孔板（免疫組織化學(xué)、茜素紅組作爬片處理）。細(xì)胞鋪滿瓶底80%后更換成骨誘導(dǎo)液（含10nmol／L地塞米松，15mmol／L維生素C，10mmol／Lβ－磷酸甘油）作不傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)7、14d，各組取3孔，按ALP試劑盒說明操作，計算ALP水平。第14天，每組3張細(xì)胞爬片，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色（SP法）。Image－Pro Plus（IPP）圖像軟件取3個區(qū)域測量（100倍，九點(diǎn)法），平均光密度代表單位面積Ⅰ型膠原水平。第21天茜素紅染色，IPP以紅色結(jié)節(jié)為標(biāo)志分析鈣結(jié)節(jié)面積（總像素數(shù)）。均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對各組數(shù)據(jù)作兩獨(dú)立樣本t檢驗，計量資料以表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs培養(yǎng)情況 原代分離48h后首次換液，鏡下貼壁細(xì)胞即為BMSCs，數(shù)量較少，呈短梭狀，散在集簇狀分布，隨培養(yǎng)時間延長及傳代后細(xì)胞形成大量的小集落，呈長梭狀，匯合成片，旋渦狀排列（圖1A）；實驗組細(xì)胞復(fù)蘇后24h內(nèi)細(xì)胞可貼壁，不貼壁細(xì)胞數(shù)目較對照組增加，細(xì)胞梭形，較瘦長，部分細(xì)胞出現(xiàn)老化，總體而言細(xì)胞生長情況影響不大（圖1B）。

圖1 凍存前后兔BMSCs生長情況（×40）

2.2 MTT檢測OD值 實驗組細(xì)胞生長潛伏期延長，MTT檢測OD值從第3天開始增加（即細(xì)胞增殖速度），第4天后增殖速度能夠與對照組持平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，n＝8），隨后進(jìn)入平臺期，見表1。

2.3 BMSCs表面標(biāo)志 實驗組、對照組表面抗原陽性率分別為 CD44：93.62% ±1.05%、93.95% ±0.71%；CD45：0.24%±0.11%、0.29%±0.10%，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），凍存復(fù)蘇對BMSCs表面抗原無明顯影響，細(xì)胞并未因凍存而發(fā)生變異，見圖2。

表1 MTT檢測OD值±s）

表1 MTT檢測OD值±s）

組別0±0.13 0.47±0.06 0.53±0.07對照組 0.03±0.00 0.06±0.00 0.18±0.04 0.38±0.03 0.48±0.07 0.53±0.08 0.54±0.07 P 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d實驗組 0.03±0.00 0.03±0.00 0.08±0.01 0.29±0.05 0.4 0.21 0.00 0.00 0.00 0.14 0.17 0.81

圖2 第10代BMSCs表面標(biāo)志表達(dá)情況

2.4 BMSCs周期檢測 實驗組與對照組G1、S、G2／M期的細(xì)胞比例及PI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 第10代BMSCs各期細(xì)胞比例±s，%）

表2 第10代BMSCs各期細(xì)胞比例±s，%）

組別 G1 S G2 57.00±3.47 33.70±3.17 9.29±0.52 42.9±3.4對照組 56.84±2.27 34.20±0.94 8.93±2.41 43.0±2.3 P PI實驗組0.933 0.756 0.768 0.960

2.5 ALP表達(dá)情況 實驗組和對照組經(jīng)成骨誘導(dǎo)后7、14d，隨誘導(dǎo)時間增加ALP水平呈遞增趨勢，兩個時間點(diǎn)實驗組和對照組ALP水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。>

2.6 Ⅰ型膠原SP法檢測 成骨誘導(dǎo)14d，實驗組和對照組Ⅰ型膠原染色均呈陽性表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，大小形態(tài)均一（圖3）。經(jīng)凍存后BMSCsⅠ型膠原蛋白表達(dá)量（平均光密度分析）變化與未凍存組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表3 成骨誘導(dǎo)后第7、14天ALP水平±s，U／gprot）

表3 成骨誘導(dǎo)后第7、14天ALP水平±s，U／gprot）

組別6.73±1.92 15.99±4.36對照組 6.76±0.91 16.41±2.22 P 7d 14d實驗組0.97 0.79

2.7 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 實驗組和對照組成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)到約10d細(xì)胞呈梭形表面粗糙，細(xì)胞間隙緊密，細(xì)碎顆粒、扁平樣改變，14d左右漩渦中心形成細(xì)胞團(tuán)，21d形成鈣化結(jié)節(jié)，肉眼可見培養(yǎng)皿底散在白色狀物，染色后均為紅色（圖4），兩組鈣結(jié)節(jié)面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

圖3 成骨誘導(dǎo)后14dⅠ型膠原染色（SP×100）

表4 Ⅰ型膠原、鈣結(jié)節(jié)染色情況±s）

表4 Ⅰ型膠原、鈣結(jié)節(jié)染色情況±s）

組別 平均光密度 鈣結(jié)節(jié)面積（像素）0.442±0.022 1 055 811.0±199 798.5對照組 0.456±0.015 1 155 874.0±222 157.3 P實驗組0.16 0.32

圖4 導(dǎo)后21d鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色（×100）

3 討 論

BMSCs在特定的條件下能向骨、軟骨、脂肪、肌等細(xì)胞分化［3］。本研究采用密度梯度離心法［4］成功分離兔BMSCs，其生長狀態(tài)良好，能夠滿足后期骨組織工程種子細(xì)胞的要求。而BMSCs體外實驗中，其隨傳代增加會使細(xì)胞老化、分化能力逐漸下降或者死亡［5］。低溫凍存BMSCs則是存貯種子細(xì)胞的有效途徑，理論上在－196℃及凍存保護(hù)液作用下細(xì)胞生化反應(yīng)與活力代謝基本靜止，可無限期凍存細(xì)胞［6］。但實際效果不佳，凍存時細(xì)胞所處環(huán)境對細(xì)胞影響較大，其機(jī)制可能為溶質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致［7］。本實驗中，短期凍存BMSCs后，雖然生長增殖速度較對照組緩慢，但細(xì)胞狀態(tài)并未發(fā)現(xiàn)明顯變化，其增殖能力能與對照組相當(dāng)。細(xì)胞周期中實驗組和對照組的絕大部分BMSCs處于G1期，具有較強(qiáng)的增殖分化能力，凍存后仍具有典型的干細(xì)胞增殖特點(diǎn)。

骨髓由多組細(xì)胞系組成，對于實驗分離得到及后續(xù)凍存復(fù)蘇后的BMSCs，是否是種子細(xì)胞或者其生物特征是否因細(xì)胞凍存過程而改變［8］。本研究通過標(biāo)記細(xì)胞陽性表達(dá)的CD44和陰性表達(dá)的CD45檢測發(fā)現(xiàn)，通過密度梯度離心法獲得的靶細(xì)胞為BMSCs，實驗組對照組CD44陽性率均超過90%，不表達(dá)的CD45，經(jīng)統(tǒng)計分析說明了經(jīng)過短期凍存后的BMSCs并沒有發(fā)生分化或變異。

BMSCs成骨、成軟骨、成脂分化這一生物特性可以用來鑒定其多向分化潛能［9－10］。BMSCs的成骨分化必須在特定條件下進(jìn)行，特定的化學(xué)物質(zhì)（β－磷酸甘油、地塞米松、維生素C等）可促使BMSCs向成骨細(xì)胞分化并能通過骨化標(biāo)志性產(chǎn)物ALP、Ⅰ型膠原、礦化結(jié)節(jié)等驗證［11］。ALP高表達(dá)是成骨過程中成熟成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志之一［12］；Ⅰ型膠原蛋白分泌量增加標(biāo)志著BMSCs向成骨細(xì)胞系分化［13］；細(xì)胞外基質(zhì)鈣化與Ca2＋沉積是成骨分化的終末期表現(xiàn)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組和對照組的BMSCs，其ALP表達(dá)量均隨誘導(dǎo)時間的增加而相應(yīng)增加；在相同時間點(diǎn)，實驗組、對照組Ⅰ型膠原蛋白均呈陽性表達(dá)，對比光密度發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量并未因凍存細(xì)胞而改變。同樣，鈣結(jié)節(jié)染色也印證了低溫冷凍過程并未使BMSCs成骨分化能力發(fā)生質(zhì)的改變。

綜上所述，本實驗旨在為臨床或?qū)嶒炑芯靠s短反復(fù)培養(yǎng)鑒定BMSCs的實驗周期，采用密度梯度離心法成功獲得純度較高的兔BMSCs，在其處于最佳狀態(tài)時給予凍存復(fù)蘇檢測其生物特征及成骨能力是否受到影響。本研究結(jié)果顯示，兔BMSCs在短期凍存后其增殖、生物特征及成骨分化潛能無明顯變化，復(fù)蘇后可用于進(jìn)一步研究和應(yīng)用。

［1］Guo KT，SchAfer R，Paul A，et al.A new technique for the isolation and surface immobilization of mesenchymal stem cells from whole bone marrow using high－specific DNA aptamers［J］.Setm Cells，2006，24（10）：2220－2231.

［2］中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于發(fā)布《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的通知［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007，23（4）：35－36.

［3］Friedenstein AJ，Chailakhyan RK，Gerasimov UV.Bone marrow osteogenic stem cells：in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers［J］.Cell Tissue Kinet，1987，20（3）：263－272.

［4］沈興，余更生，田杰，等.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及凍存研究［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（9）：996－997.

［5］Lippens E，Cornelissen M.Slow cooling cryopreservation of cell－microcarrier constructs［J］.Cells Tissues Organs，2010，192（3）：177－186.

［6］Rust PA，Costas C，Cannon SR，et al.Characterisation of cryopreserved cells freshly isolated from human bone marrow［J］.Cryo Letters，2006，27（1）：17－28.

［7］雷香麗.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植實驗性研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

［8］McCarty RC，Gronthos S，Zannettino AC，et al.Characterisation and developmental potential of ovine bone marrow derived mesenchymal stem cells［J］.J Cell Physiol，2009，219（2）：324－333.

［9］Baksh D，Song L，Tuan RS.Adult mesenchymal stem cells：characterization，differentiation，and application in cell and gene therapy［J］.J Cell Mol Med，2004，8（3）：301－316.

［10］Tuli R，Tuli S，Nandi S，et al.Transforming growth factor－beta－mediated chondrogenesis of human mesenchymal progenitor cells involves N－cadherin and mitogen－activated protein kinase and Wnt signaling cross－talk［J］.J Biol Chem，2003，278（42）：41227－41236.

［11］Qu D，Li J，Li Y，et al.Angiogenesis and osteogenesis enhanced by bFGF ex vivo gene therapy for bone tissue engineering in reconstruction of calvarial defects［J］.J Biomed Mater Res A，2011，96（3）：543－551.

［12］Collignon H，Davicco MJ，Barlet JP.Isolation of cells from ovine fetal long bone and characterization of their osteoblastic activities during in vitro mineralization［J］.Arch Physiol Biochem，1997，105（2）：158－166.

［13］Salasznyk RM，Williams WA，Boskey A，et al.Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Biotechnol，2004，2004（1）：24－34.

［14］Klees RF，Salasznyk RM，Kingsley K，et al.Laminin－5induces osteogenic gene expression in human mesenchymal stem cells through an ERK－dependent pathway［J］.Mol Biol Cell，2005，16（2）：881－890.