亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦成蝦的毒性及其抗病因子的影響

鐘君偉，朱永安，付佩勝,安麗，呂寶玉（山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013）

在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中，尤其是高密度養(yǎng)殖模式下，人工向水體投入大量的配合飼料，水體中有機(jī)代謝廢物大量沉積，特別是亞硝酸鹽濃度逐漸升高，往往引起水產(chǎn)動(dòng)物的的生理異常甚至死亡，其產(chǎn)生的毒性作用直接影響動(dòng)物的存活、生長(zhǎng)和發(fā)育，成為誘發(fā)病害的主要因子。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究了亞硝酸鹽對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的急性毒性效應(yīng)，進(jìn)行了病理學(xué)研究并探討了其中毒機(jī)理[1－5]。

克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii）俗稱淡水小龍蝦，分類學(xué)上屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱軟甲亞綱十足目螯蝦亞目蜊蛄科原螯蝦屬，原產(chǎn)北美洲，20世紀(jì)30年代末由日本傳入我國(guó)。由于其因肉味鮮美，適應(yīng)性廣、繁殖力強(qiáng)，能適應(yīng)稻田、池塘、灘地等多種水域養(yǎng)殖，已成為我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蝦類，是目前我國(guó)水產(chǎn)業(yè)中發(fā)展最為迅速、最具特色、最有潛力的養(yǎng)殖品種之一。目前對(duì)克氏原螯蝦的研究主要集中在繁殖生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)生理、基礎(chǔ)代謝、重金屬污染等方面[6－11]，而有關(guān)環(huán)境因子亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦影響，僅見(jiàn)于對(duì)幼蝦、仔蝦的急性毒性效應(yīng)研究[12－13]，未見(jiàn)對(duì)其成蝦的毒性效應(yīng)報(bào)道及其亞硝酸鹽脅迫對(duì)相關(guān)免疫指標(biāo)的影響。本研究不僅探討了亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性效應(yīng)，而且進(jìn)一步測(cè)定其在安全濃度狀態(tài)下克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶 （T-SOD）、過(guò)氧化氫酶 （CAT）、酸性磷酸酶 （ACP）和堿性磷酸酶 （AKP）活性在72h內(nèi)的變化情況，以進(jìn)一步探明克氏原螯蝦受到亞硝酸鹽作用后相關(guān)免疫因子的變化情況，為克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用克氏原螫蝦體重為 （9.32±1.57）g，體長(zhǎng)為 （6.91±0.41）cm，取自山東省東平縣第一淡水養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)，在室內(nèi)暫養(yǎng)7d。暫養(yǎng)和試驗(yàn)容器均為裝有20L水的塑料水族箱 （57cm×40cm×34cm），試驗(yàn)前24h停食，并從中選擇體質(zhì)健壯、體色一致、活動(dòng)性強(qiáng)和附肢完整的成蝦作為試驗(yàn)用蝦。

試驗(yàn)在山東省淡水漁業(yè)研究院國(guó)家級(jí)水產(chǎn)良種場(chǎng)溫室中進(jìn)行，試驗(yàn)水源為玉景礦泉水廠700m深井水，其水質(zhì)指標(biāo)如下：水溫 （20.9±2.9）℃，pH 7.86，DO （5.24±0.63）mg／L，溶解性總固體（TDS）（0.44±0.05）mg／L；0.03mg／L；未檢出。試驗(yàn)期間采用24h連續(xù)充氣增氧，試驗(yàn)期間不控溫不投喂。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性試驗(yàn) 經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)，確定各組藥物質(zhì)量濃度范圍 （96h全活質(zhì)量濃度上限和24h全部致死質(zhì)量濃度下限）后，在室溫條件下，采用半靜水停食實(shí)驗(yàn)法，按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置7個(gè)質(zhì)量濃度梯度組 （16.00、24.11、36.32、54.72、82.44、124.20mg／L和187.12mg／L）和1個(gè)清水對(duì)照組，每組3個(gè)平行，為保證試驗(yàn)期間藥物濃度的穩(wěn)定，每24h全部換液1次。

試驗(yàn)開(kāi)始的前10h連續(xù)觀察，及時(shí)取出死亡成蝦并排污，記錄24、48、72、96h各組蝦的癥狀及死亡數(shù)。其死亡的個(gè)體以鑷子碰觸蝦體腹部完全無(wú)反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，參照譚蘋(píng)[14]的方法，按改良寇氏法求出各藥物的半數(shù)致死質(zhì)量濃度 （LC50），再求得安全濃度 （SC）。

安全濃度 （SC）＝48hLC50×0.3／ （24hLC50／48hLC50）2

式中，24hLC50、48hLC50分別為24、48h的半致死質(zhì)量濃度。

（2）亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦抗病因子影響試驗(yàn) 脅迫濃度在安全濃度 （12.32mg／L）基礎(chǔ)上設(shè)置為12mg／L亞硝酸鹽氮濃度組和0mg／L對(duì)照組。準(zhǔn)確稱取亞硝酸鈉放入裝有20L水的塑料水族箱 （57cm×40cm×34cm）溶解完全后，每試驗(yàn)組隨機(jī)放入活性旺盛的克氏原螯蝦20只，每平行重復(fù)2組。持續(xù)充氣，每24h更換試驗(yàn)溶液1次以維持藥物濃度。

于脅迫后12、24、48、60h和72h分別從試驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)取出3只蝦，在冰上迅速采集肝胰腺組織樣品，分別加9倍質(zhì)量0.85%預(yù)冷無(wú)菌生理鹽水制備成10%的組織勻漿，在冰浴條件下進(jìn)行勻漿。勻漿液經(jīng)3000r／min4℃離心15min，吸取上清液于潔凈的離心管中－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒分別測(cè)定肝胰腺的氧化物歧化酶 （T-SOD）、過(guò)氧化氫酶 （CAT）、酸性磷酸酶 （ACP）和堿性磷酸酶 （AKP）活性，測(cè)定方法按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)樣品重復(fù)2次。T-SOD定義為每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活性單位 （U／mgProt）；組織中CAT以1mg蛋白1s分解1μmol的H2O2的量為1個(gè)活性單位 （U／mgProt）；ACP定義為每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)活性單位（U／gProt）；AKP定義為每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)活性單位（U／gProt）；采用考馬斯亮藍(lán)顯色法測(cè)定總蛋白含量，單位為g／L。

脅迫影響的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理，并采用雙尾t檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以P≤0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦的毒性

試驗(yàn)初期，試驗(yàn)組克氏原螯蝦活動(dòng)狀況與對(duì)照組基本相似，都散落在箱體底部緩慢爬動(dòng)，碰觸后反應(yīng)敏捷。隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，克氏原螯蝦在不同試驗(yàn)組中出現(xiàn)不同程度的游動(dòng)加劇、上下串游、游動(dòng)遲緩等不安狀況。試驗(yàn)開(kāi)始5h后，124.20mg／L和187.12mg／L濃度組出現(xiàn)中毒癥狀，部分成蝦急躁不安，沿箱壁快速游動(dòng)。7h后行動(dòng)減緩，不時(shí)側(cè)游、側(cè)翻，游泳足擺動(dòng)緩慢，若受觸動(dòng)，能迅速逃游，但片刻后又側(cè)翻、側(cè)游，有部分蝦腹部朝上彎曲，反應(yīng)遲鈍。10h后187.12mg／L組平均已有4尾身體彎曲，體色變暗，活動(dòng)微弱，若受驚，已不能逃游，呈昏迷狀態(tài)，沉入水底不動(dòng)。24h后死亡成蝦體色變暗，頭胸部與腹部有明顯的分節(jié)。

表1為亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果。在一定試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，隨著的濃度越高，克氏原螯蝦的死亡率越高；而在相同的染毒時(shí)間內(nèi)，濃度越高，克氏原螯蝦的死亡率越高。依據(jù)表1的數(shù)據(jù)，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算對(duì)克氏原螯蝦的24、48、72h和96hLC50（95%可信 區(qū) 間 ） 分 別 為 118.00mg／L （94.21～147.78mg／L）、83.00mg／L （65.87～104.59mg／L）、41.07mg／L （32.97～51.16mg／L）和 35.70mg／L （29.03～43.92mg／L），安全質(zhì) 量 濃 度 （SC）為12.32mg／L。

表1 亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺T-SOD和CAT活性的影響

水體中亞硝酸鹽氮在安全濃度內(nèi)對(duì)克氏原螯蝦成蝦肝胰腺抗氧化酶類活性影響如圖1所示。對(duì)照組肝胰腺T-SOD活性在60h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，呈小幅波動(dòng)，差異不顯著 （P＞0.05），隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，在72h時(shí)顯著降低至（15.24±2.99）U／mgProt；在12mg／L脅迫24h后，肝胰腺T-SOD活性迅速降低 （P＜0.05），此后T-SOD活性均明顯低于對(duì)照組 （P＜0.05），除48h外，抑制程度逐漸增加，在72h時(shí)抑制程度最高為37.77%。說(shuō)明12mg／L對(duì)肝胰腺T-SOD活性影響主要表現(xiàn)為抑制作用，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制程度加深。

對(duì)照組肝胰腺CAT活性在72h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，呈小幅波動(dòng)，差異不顯著 （P＞0.05）；在12mg／L脅迫12h后，肝胰腺T-SOD活性迅速降低（P＜0.05），在24h時(shí)抑制程度最高為55.18%。雖在60h后CAT活性有所上升，但明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明在12mg／L對(duì)肝胰腺CAT活性影響主要表現(xiàn)為抑制作用，且抑制時(shí)間要早于T-SOD。

圖1 亞硝酸鹽氮脅迫對(duì)克氏原螯蝦抗氧化酶類活性的影響

2.3 亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺酸、堿磷酸酶活性的影響

水體中亞硝酸鹽氮在安全濃度內(nèi)對(duì)克氏原螯蝦成蝦肝胰腺酸、堿磷酸酶活性的影響如圖2所示。圖2顯示：整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，在12mg／L脅迫下，克氏原螯蝦肝胰腺ACP和AKP活性表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，即在12h時(shí)均顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），其中 ACP達(dá)到 （255.65±36.22）U／gProt，AKP升高至 （14.50±1.96）U／gProt；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，試驗(yàn)組ACP和AKP活性迅速降低至對(duì)照組水平，且差異不顯著 （P＞0.05）。說(shuō)明克氏原螯蝦肝胰腺ACP和AKP能在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)12mg／L脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，并能快速適應(yīng)脅迫環(huán)境。

圖2 亞硝酸鹽氮脅迫對(duì)克氏原螯蝦酸、堿磷酸酶活性的影響

3 討論

亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中重要的污染物，是導(dǎo)致甲殼動(dòng)物免疫能力降低、疾病發(fā)生的重要因素，可引起機(jī)體生理生化因子及組織結(jié)構(gòu)的改變，并能改變與免疫抗病能力有關(guān)酶類的活性。在試驗(yàn)過(guò)程中，中毒克氏原螯蝦先表現(xiàn)為游動(dòng)加劇，后動(dòng)作遲緩；死亡個(gè)體體色變暗，頭胸部與腹部有明顯的分節(jié)。其安全質(zhì)量濃度 （SC）為12.32mg／L，是幼蝦[12]（SC 為6.97mg／L）及仔蝦[13]（SC 為1.52mg／L）的1.77倍和8.11倍，這說(shuō)明克氏原螯蝦對(duì)的耐受力隨個(gè)體發(fā)育而逐漸增強(qiáng)。

亞硝酸鹽中毒組織病變最嚴(yán)重的器官是肝胰腺[15]，且會(huì)對(duì)甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，使其免疫功能下降。王玥等[16]以1mg／L的亞硝態(tài)氮作用于羅氏沼蝦10d后，使其血清、肝胰腺和肌肉組織中的PO、SOD、ACP及AKP的活性顯著降低，降低了該蝦的免疫功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，12mg／L對(duì)肝胰腺T-SOD及CAT活性影響主要表現(xiàn)為抑制作用，且CAT活性且抑制時(shí)間要早于T-SOD，T-SOD活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制程度加深。說(shuō)明即使處于安全濃度內(nèi)，12mg／L仍會(huì)抑制肝胰腺T-SOD及CAT活性，導(dǎo)致清除體內(nèi)氧自由基能力降低，對(duì)克氏原螯蝦產(chǎn)生一定毒性。

在甲殼動(dòng)物的免疫體系中，ACP和AKP均為磷酸單酯酶，主要分布在肝胰腺、血淋巴中，是甲殼動(dòng)物溶酶體酶的重要組成成分，在免疫應(yīng)答中起重要的作用。肝胰腺作為重要的解毒器官和脂肪代謝場(chǎng)所，其中具有水解酶作用的ACP含量較為豐富，因而ACP活力必然高得多，這點(diǎn)在本研究中也得到進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中肝胰腺ACP和AKP除在12h時(shí)活性顯著增強(qiáng)外，其他時(shí)間下與對(duì)照組差異并不明顯，因此克氏原螯蝦肝胰腺ACP和AKP能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)12mg／L應(yīng)激產(chǎn)生響應(yīng)，并能盡快適應(yīng)。這點(diǎn)與對(duì)紅螯光殼螯蝦幼蝦肝胰腺ACP和AKP的抑制影響不同[5]，這可能與受試物種、蝦體規(guī)格或試驗(yàn)條件有關(guān)。

《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽不高于0.2mg／L，而對(duì)克氏原螯蝦成蝦的安全濃度分別為12.32mg／L，是水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的，61.6倍，說(shuō)明克氏原螯蝦成蝦能搞耐受較高濃度的；但即使處于安全濃度內(nèi)，雖然不會(huì)導(dǎo)致成蝦死亡，12mg／L依然能夠抑制抑制肝胰腺T-SOD及CAT活性。

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