超聲波協(xié)同半仿生法提取廣金錢草總黃酮工藝研究△

郭楚楚，程軒軒，李嘉榮，唐曉敏，張春榮，楊全

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

中藥工業(yè)

超聲波協(xié)同半仿生法提取廣金錢草總黃酮工藝研究△

郭楚楚，程軒軒，李嘉榮，唐曉敏，張春榮，楊全*

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：研究超聲波輔助半仿生法提取廣金錢草總黃酮的最佳工藝條件。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，考察料液比、超聲功率和提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，建立二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型。繪制以總黃酮含量為響應(yīng)值的等高線圖和響應(yīng)曲面，討論各因素間的交互作用。結(jié)果：回歸模型擬合性良好，置信度較高。優(yōu)選的提取工藝為：以pH=2.0，7.5，8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑，料液比為1∶40，室溫下超聲提取39 min，重復(fù)提取3次，功率為340 W。在此條件下，總黃酮的提取量為1.879 4 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相符度為96%。結(jié)論：采用響應(yīng)面優(yōu)化的半仿生提取工藝穩(wěn)定可行，不使用有機(jī)試劑有利于降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)綠色化生產(chǎn)。

廣金錢草；總黃酮；半仿生法；響應(yīng)面法

廣金錢草為豆科植物廣金錢草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分，異名馬蹄草、落地金錢。本品性涼，味甘、淡，具有利濕退黃、利尿通淋的功能，用于黃疸尿赤，熱淋，石淋，小便澀痛、水腫尿少[1]。廣金錢草在民間用于治療腎、肝、膽結(jié)石，療效顯著，是一種具有廣闊開發(fā)前景的廣東道地藥材[2]。本品既可以不帶根全草入藥，還可作為主要原料生產(chǎn)中成藥，如“消石飲”、“石淋通”、“消炎利膽片”、“消石片”、“金錢草沖劑”等，臨床應(yīng)用廣泛[3]。植物化學(xué)研究表明廣金錢草中含有黃酮、生物堿、酚類、鞣質(zhì)和多糖等成分[1]?，F(xiàn)代藥理已證實(shí)廣金錢草總黃酮能明顯增加小鼠心肌營(yíng)養(yǎng)性血流量、在體狗冠脈及腦血流量、小鼠常壓缺氧耐受力，緩解家兔離體血管條的痙攣，在體外還能顯著抑制血小板聚集和血栓形成[4-5]。

半仿生提取法是從生物藥劑學(xué)的角度將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，模擬口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，采用不同pH值的酸性水和堿性水依次連續(xù)提取的方法，其目的是盡可能地提取和保留原藥中的有效成分[6-8]。此法具有適合工業(yè)化生產(chǎn)、同時(shí)體現(xiàn)中醫(yī)防病綜合成分作用的特點(diǎn)[9]。本研究采用超聲波協(xié)同半仿生法對(duì)廣金錢草總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以期篩選最佳提取工藝參數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)利用廣金錢草提供參考。

1 儀器與材料

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；YJ-10高速中藥粉碎機(jī)(上海永久制藥機(jī)械有限公司)；UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；FA2204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；PHS-25型數(shù)字pH計(jì)(上海盛磁儀器有限公司)；PH2T-92VOA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；TG-16WS臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)。

廣金錢草購(gòu)于廣東清平中藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥學(xué)院楊全教授鑒定為豆科植物廣金錢草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的全草；蘆丁對(duì)照品(上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：20130509，純度>98%)；磷酸二氫鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸、乙醇等均為分析純(天津百世化工有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水(文中無特殊說明的溶液，配制溶劑均為蒸餾水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁對(duì)照品5 mg，用60%乙醇溶解，定容至50 mL，制成0.1 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液。分別吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于10 mL容量瓶中，依次加入60%乙醇1 mL、5%亞硝酸鈉(NaNO2)溶液0.3 mL，搖勻后放置10 min；加入10%硝酸鋁[Al(NO3)3]溶液0.3 mL，搖勻后放置10 min；加入4%氫氧化鈉(NaOH)溶液2.0 mL，最后用60%乙醇定容至10 mL，搖勻靜置15 min。于510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，總黃酮的質(zhì)量濃度X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=10.24X-0.065(r=0.999 9)，線性范圍為20.0～60.0 μg·mL-1。

2.2 供試品溶液的制備

根據(jù)仿生學(xué)原理，人體胃、小腸、大腸的體液酸度最佳pH分別為2.0，7.5，8.3[10]。準(zhǔn)確稱取干燥的廣金錢草粉末(過二號(hào)篩)1 g，置于具塞錐形瓶中，依次加入pH為2.0，7.5，8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，在一定的料液比、功率和時(shí)間條件下超聲提取，過濾，合并3次提取液，濃縮，定容。

2.3 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取廣金錢草提取液2 mL，置于10 mL容量瓶中，按照2.1方法依次加入NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液，搖勻靜置后，用60%乙醇定容至刻度線，于510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算廣金錢草總黃酮的提取率。計(jì)算公式：X=C×V1×V2/(M×V3)，X為樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g-1)；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中黃酮的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；V1為稀釋體積(mL)；V2為樣品溶液體積(mL)；M為樣品重量(g)；V3為取樣體積(mL)。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取廣金錢草粉末6份，每份1 g，置于具塞錐形瓶中，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，在功率為300 W條件下于pH為2.0，7.5，8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中分別超聲提取，每次提取30 min，合并3次提取液，濃縮，定容。其余操作同2.3方法，考察料液比對(duì)廣金錢草總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖1。隨著料液比的增加，黃酮提取量呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶40后，總黃酮量的增加趨于平緩，說明黃酮的浸出已達(dá)動(dòng)態(tài)平衡。從提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮，最佳料液比確定為1∶40。

圖1 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響

2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取廣金錢草粉末6份，每份1 g，置于具塞錐形瓶中，在料液比為1∶40、功率為300 W條件下于pH為2.0，7.5，8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中分別超聲提取，每次提取時(shí)間為10，20，30，40，50，60 min，合并3次提取液，濃縮，定容。其余操作同2.3方法，考察超聲時(shí)間對(duì)廣金錢草總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖2。廣金錢草總黃酮的提取量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是達(dá)到40 min后，進(jìn)一步增加提取時(shí)間，總黃酮含量出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)。過長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用可能導(dǎo)致部分黃酮發(fā)生降解，含量隨之下降。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

2.4.3 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取廣金錢草粉末6份，每份1 g，置于具塞錐形瓶中，按照1∶40的料液比于pH為2.0，7.5，8.3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中分別超聲提取，提取功率分別為250，300，350，400，450，500 W，每次提取40 min，合并3次提取液，濃縮，定容。其余操作同2.3方法，以考察功率對(duì)黃酮含量的影響。由圖3可知，功率越高對(duì)藥材細(xì)胞的破壞作用越大，溶劑擴(kuò)散也越快，越有利于有效成分的浸出。當(dāng)功率大于350 W時(shí)，進(jìn)一步增加功率則黃酮含量反而下降，可能由于過高的超聲功率產(chǎn)生的瞬間高溫會(huì)使黃酮類成分遭到破壞，同時(shí)雜質(zhì)溶出較多，故確定350 W為適宜的提取功率。

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮提取量的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化廣金錢草總黃酮提取工藝

2.5.1 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Design Expert 8.0.5軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[11-12]，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲功率和提取時(shí)間3個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、表2。

表1 廣金錢草總黃酮提取工藝響應(yīng)面分析因素與水平表

表2 廣金錢草總黃酮提取工藝響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

2.5.2 模型的建立及回歸分析 采用響應(yīng)面法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到以廣金錢草總黃酮含量為響應(yīng)值的回歸方程：Y=1.760 6+0.014 5A-0.020 7B-0.204 1C-0.028 9AB+0.022 2AC-0.034 7BC+0.013 2A2-0.152 5B2-0.454 4C2。式中Y為總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g-1)；A為料液比；B為提取時(shí)間(min)；C為超聲功率(W)。

由表3回歸模型方差分析可知，二次方程模型的“Prob>F”值<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著，說明該試驗(yàn)方法可靠，使用該方程模擬真實(shí)的三因素三水平分析是可行的。同時(shí)，失擬相P=0.116 7>0.05(不顯著)，表明模型不存在失擬因素，試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可以用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。其方程的相關(guān)系數(shù)r=0.997 616，rAdj=0.994 551，表明99.76%的數(shù)據(jù)可以用該方程解釋。變異系數(shù)CV=1.45%，反映模型的置信度較高，模型方程能較好反映真實(shí)的試驗(yàn)值，可用此模型分析響應(yīng)值的變化。由“Prob>F”值可知，B、C、AB、BC、B2、C2均為二次回歸模型的顯著性因素(P<0.01)。3個(gè)主因素對(duì)總黃酮得率的影響順序?yàn)椋汗β?時(shí)間>料液比。

表3 廣金錢草總黃酮提取工藝回歸模型方差分析

圖4～6是根據(jù)回歸方程所得的各因素對(duì)總黃酮含量影響的三維響應(yīng)曲面和等高線圖。圖中分別將超聲功率、料液比和提取時(shí)間固定在0水平，可以直觀分析各因素及任意兩因素之間的交互作用對(duì)總黃酮含量影響效應(yīng)的大小。圖4和圖5的等高線密集且呈橢圓形，響應(yīng)面較陡，說明料液比和提取時(shí)間、提取時(shí)間和超聲功率之間的交互作用顯著。此結(jié)論可驗(yàn)證表3的方差分析結(jié)果。

應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳提取工藝參數(shù)：料液比為1∶40，提取時(shí)間為38.6 min，超聲功率為340.29 W，預(yù)測(cè)響應(yīng)值廣金錢草總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.809 5 mg·g-1。

2.5.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取廣金錢草粉末1 g，在最佳條件下提取，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，計(jì)算總黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.879 4 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相符度為96.28%。

3 討論

圖4 料液比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的三維響應(yīng)面與等高線圖

圖5 提取時(shí)間和超聲功率對(duì)總黃酮得率的三維響應(yīng)面與等高線圖

圖6 料液比和超聲功率對(duì)總黃酮得率的三維響應(yīng)面與等高線圖

響應(yīng)面分析(RSM)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過分析回歸方程來求得最佳工藝參數(shù)，以解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。具有試驗(yàn)周期短、回歸方程準(zhǔn)確度高、能研究多因素交互作用等優(yōu)點(diǎn)[9]。

采用半仿生法提取廣金錢草中總黃酮，用響應(yīng)面分析法考察料液比、提取時(shí)間、超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果表明：在考察的因素水平范圍內(nèi)，提取時(shí)間、超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，因素間的交互作用明顯。經(jīng)過工藝優(yōu)化，考慮到操作的方便性，廣金錢草總黃酮的最佳提取條件調(diào)整為：料液比1∶40，提取時(shí)間39 min，超聲功率340 W，用此工藝提取總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)1.879 4 mg·g-1。半仿生提取法模擬人體口服給藥過程，不使用有機(jī)試劑，減少對(duì)環(huán)境及生產(chǎn)人員的身體傷害，利于降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)綠色化生產(chǎn)。

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StudyonExtractionTechnologyofTotalFlavonoidsfromDesmodiumstyracifoliumbyUltraconicandSemi-bionicMethods

GUO Chuchu，CHENGXuanxuan，LIJiarong，TANGXiaomin，ZHANGChunrong，YANGQuan*

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective:To optimize ultrasonic and semi-bionic extraction conditions for total flavonoids fromDesmodiumstyracifolium.Methods：According to Box-Behnken design principle and results of single-factor experiments，the effects of liquid/solid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time on the total flavonoids yield were explored by three factors and three levels of response surface analysis method.The prediction model for quadratic polynomial regression equation was established，and the response surface and contour line map were analyzed to discuss the interaction between different factors.Results：Regression model had good fitness and confidence.Optimum extraction technology conditions were as follows：the extracting solvent was disodium hydrogen phosphate-citric acid buffer solution(pH=2.0，7.5 and 8.3)，and the ratio of solid-liquid was 1∶40；the ultrasonic time was 38.6 min for 3 times and ultrasonic power was 340 W.Under the optimal conditions，the extract of total flavonoids was 1.879 4 mg·g-1and the predictable value was 1.809 5 mg·g-1.Conclusion：The optimized extraction technology was stable and low-cost，which could be used for non-pollution production.

Desmodiumstyracifolium；Total flavonoids；Semi-bionic method；Response surface method

2014-04-15)

廣東省中山市科技局華南現(xiàn)代中醫(yī)藥城項(xiàng)目(20101H020)

*

楊全，教授，研究方向：中藥資源與道地性研究；E-mail：yangquan7208@vip.163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.013