白及種子試管高頻萌發(fā)的應(yīng)用研究△

宋曉丹，陳曉玲，尚麗，楊培君

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

白及種子試管高頻萌發(fā)的應(yīng)用研究△

宋曉丹，陳曉玲，尚麗，楊培君*

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

目的：探討適合白及種子試管高頻萌發(fā)及壯苗生根的培養(yǎng)條件，以獲得大量種苗。方法：采用白及當(dāng)年未裂開(kāi)的成熟果實(shí)，經(jīng)表面消毒處理，通過(guò)MS的不同組方培養(yǎng)基，開(kāi)展種子試管萌發(fā)和生根培養(yǎng)。結(jié)果：適合白及種子試管苗高頻萌發(fā)環(huán)境為光環(huán)境，最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg·L-1+AC 6.0 g·L-1，萌發(fā)率可達(dá)98%以上；1/2 MS培養(yǎng)基適合壯苗及易于生根培養(yǎng)，生根率達(dá)95%以上；平均移栽成活率可達(dá)85%。結(jié)論：白及組培研究雖有報(bào)道，但本研究結(jié)果提供了一種簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的白及種子試管快速萌發(fā)技術(shù)，有助于推動(dòng)白及規(guī)?；斯しN植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

白及；種子；試管萌發(fā)

白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.為蘭科白及屬多年生草本植物，又名白芨；產(chǎn)陜西南部、甘肅東南部、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川和貴州；生于海拔100～3200 m的常綠闊葉林下，櫟樹(shù)林或針葉林下、路邊草叢或巖石縫中，朝鮮半島和日本也有分布[1-2]。白及塊莖為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具收斂止血，消腫生肌功效；用于咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂[3]。白及不僅在醫(yī)藥上用途廣泛，在化妝品上也有廣泛的應(yīng)用[4]，白及膠在醫(yī)學(xué)研究和臨床等諸多方面有廣泛的應(yīng)用，在治療胃、食道炎及十二指腸潰瘍和穿孔、出血糜爛性胃炎等效果顯著[5]；白及粉粒是一種理想的肝癌血管栓塞劑[6]；白及還可外用于凍瘡和皮膚皸裂等[7]。白及膠具有補(bǔ)充肌膚營(yíng)養(yǎng)，消除體內(nèi)過(guò)量自由基，延緩肌膚衰老的作用[4]。此外，白及花色艷麗，也具良好的觀賞價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊。

蘭科植物種子萌發(fā)率極低，須有相適應(yīng)的真菌侵染種子后，才能提高種子的自然萌發(fā)率[8]。白及自然繁殖困難，野生資源稀少，是我國(guó)一種珍稀保護(hù)植物資源[9]。由于白及用途廣泛，其需求量較大，而長(zhǎng)期采挖導(dǎo)致野生資源急劇減少，無(wú)法供應(yīng)市場(chǎng)需求；目前，白及主要依賴人工栽培，多以小塊莖作為繁殖材料。有關(guān)白及的組織培養(yǎng)研究已有許多報(bào)道[10-14]，但存在培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高、不易應(yīng)用等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用白及成熟果實(shí)的種子為材料，在不同培養(yǎng)基上進(jìn)行無(wú)菌播種，利用試管培養(yǎng)的方法進(jìn)行誘導(dǎo)種子萌發(fā)、壯苗生根，篩選出適合種子萌發(fā)及試管苗培養(yǎng)的最佳條件，為白及的規(guī)?；a(chǎn)提供一種簡(jiǎn)單、有效、低成本、應(yīng)用性強(qiáng)的種子試管高頻萌發(fā)與擴(kuò)繁技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為白及成熟未開(kāi)裂果實(shí)的種子，2013年10月采自于陜西留壩縣江口人工種植的優(yōu)良白及成熟蒴果。

1.2 方法

1.2.1 材料無(wú)菌處理 取白及成熟蒴果，將2～3個(gè)果實(shí)置于紗布包好，自來(lái)水沖洗6～8 h；在凈化工作臺(tái)中用無(wú)菌水沖洗1次，75%乙醇消毒30 s左右，無(wú)菌水沖洗1次；0.1%升汞中浸泡10～11 min；無(wú)菌水沖洗3～4次。

1.2.2 種子萌發(fā)誘導(dǎo) 將消毒處理后的白及成熟果實(shí)先端切開(kāi)，適量種子均勻撒布于萌發(fā)培養(yǎng)基表面。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的種子萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基有：1/2 MS，1/2 MS+GA 0.5 mg·L-1，1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1，MS+NAA 1.0 mg·L-1；并將培養(yǎng)基分成2組，其中1組添加活性炭(AC)4.0～6.0 g·L-1。以此比較、篩選適合白及種子有效萌發(fā)的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng) 選取光照條件下培養(yǎng)40 d左右，高度約1.5～2.0 cm并有葉片展開(kāi)的白及試管苗，將其轉(zhuǎn)接到篩選出的1/2 MS培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)瓶接5～7株小苗，進(jìn)行壯苗及誘根生長(zhǎng)的培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)條件 萌發(fā)誘導(dǎo)及壯苗條件：前20 d分三組培養(yǎng)，一組為暗環(huán)境人工氣候箱培養(yǎng)(遮光處理，溫度23 ℃，濕度80%)；另一組為光環(huán)境人工氣候箱培養(yǎng)(光照：40 μmol·m-2·s-1，溫度23 ℃，濕度80%)；第三組為弱光室溫培養(yǎng)(培養(yǎng)室內(nèi)弱自然光：20 μmol·m-2·s-1，室溫20～10 ℃，濕度65%)。后期培養(yǎng)溫度為24±2 ℃，相對(duì)濕度66%～85%，光照12 h·d-1，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1。

1.3 結(jié)果觀察與統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)每種培養(yǎng)基中種子萌發(fā)數(shù)及萌發(fā)誘導(dǎo)率，觀察不同培養(yǎng)基對(duì)苗的影響及生長(zhǎng)情況。萌發(fā)誘導(dǎo)率=萌發(fā)種子數(shù)/接種數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)誘導(dǎo)

在實(shí)驗(yàn)的各培養(yǎng)基上，白及種子的最大萌發(fā)率能達(dá)到100%。但因培養(yǎng)基所加的激素及培養(yǎng)條件的不同，導(dǎo)致促萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)短不一，萌發(fā)率以及幼苗生長(zhǎng)狀況有差異。

種子萌發(fā)與光的關(guān)系一直受到廣泛關(guān)注[15]。白及種子培養(yǎng)10 d時(shí)，光環(huán)境下的種子開(kāi)始出現(xiàn)萌發(fā)跡象，種子吸脹并由黃褐色變成綠色；20 d時(shí)綠色芽點(diǎn)顏色明顯變深，黃褐色消失；25 d時(shí)接近最大萌發(fā)率，綠芽周圍出現(xiàn)細(xì)小白色毛狀物，第一片幼小真葉長(zhǎng)出(圖1：4，5)，培養(yǎng)40 d后，可生長(zhǎng)2～3片幼葉(圖1：6)。相比之下，室溫弱光環(huán)境中的白及種子在第15 d時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，暗環(huán)境下的種子在20d后開(kāi)始萌發(fā)。暗環(huán)境中的種子整體萌發(fā)比光照環(huán)境中的萌發(fā)晚，且在同種培養(yǎng)基中萌發(fā)率也低于光照環(huán)境中。結(jié)果表明光照有利于促進(jìn)白及種子的萌發(fā)。

活性炭具有促進(jìn)組培苗植物生根的作用[16]。根據(jù)表1的種子萌發(fā)率可知，在同一培養(yǎng)基、同一培養(yǎng)環(huán)境下，含活性炭的培養(yǎng)基中白及種子萌發(fā)率明顯高于不含活性炭的培養(yǎng)基。白及種子在光環(huán)境下，以MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，可達(dá)到100%，且幼苗粗壯；1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)培養(yǎng)基中萌發(fā)率次之，達(dá)95%以上，幼苗纖細(xì)；自然環(huán)境中兩種培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率也相對(duì)較高，分別是71.4%和80.0%；暗環(huán)境中的種子萌發(fā)率最低，僅有21.0%和32.4%(表1，圖1：1～6)。

綜上所述，培養(yǎng)基組份、光照和溫度對(duì)白及種子萌發(fā)均有明顯的影響。適合白及種子試管高頻萌發(fā)誘導(dǎo)的條件為光環(huán)境培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)。

1～3.白及種子在MS+NAA 1.0 mg·L-1(AC)培養(yǎng)基、光照條件下萌發(fā)，分別為10d，25d，35d；4～6.白及種子在1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基、光照條件下萌發(fā)，分別為15d，30d，40d；7～10.白及在1/2 MS培養(yǎng)基中生根壯苗，分別為15d，30d，50d，70d；11.白及試管苗，50d；12.移栽于植苗盤(pán)中幼苗的生長(zhǎng)與管理圖1 白及種子高效試管萌發(fā)培養(yǎng)

表1 不同培養(yǎng)條件對(duì)白及種子萌發(fā)率的影響(25 d)

注：+表示含有活性炭，-表示沒(méi)有活性炭。

2.2 壯苗生根培養(yǎng)

取生長(zhǎng)狀況良好且長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，苗高1.5 cm左右，有葉片展開(kāi)的幼苗轉(zhuǎn)接到1/2 MS壯苗生根培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基瓶中接5～7株幼苗，培養(yǎng)條件為光照40 μmol·m-2·s-1，12 h光照，培養(yǎng)溫度25±2℃。經(jīng)30 d培養(yǎng)后，幼苗粗壯，長(zhǎng)勢(shì)均勻，葉片較寬；產(chǎn)生根1～3條，根長(zhǎng)3～5 mm，并且基部產(chǎn)生直徑2～3 mm的小塊莖(圖1：7～9)。培養(yǎng)50 d后，根長(zhǎng)達(dá)15～20 mm，小塊莖迅速膨大，有的基部可產(chǎn)生2～3個(gè)塊莖(圖1：10～11)。

2.3 移栽

當(dāng)試管苗生長(zhǎng)至4～5 cm高，根系發(fā)達(dá)且根部有膨大的塊莖時(shí)移栽效果最好。此時(shí)，先解開(kāi)封口膜扎繩1～2 d后，松開(kāi)封口膜，但不是完全去掉；再經(jīng)2～3 d移去封口膜，煉苗3～5 d后即可移栽。

選用植苗盤(pán)，先覆好基質(zhì)，澆足水；移苗基質(zhì)為腐殖土和壤土加沙土(1∶1)。移栽時(shí)，從培養(yǎng)瓶中小心取出苗，用清水沖洗掉根部的培養(yǎng)基，避免傷害根系；用鑷子在基質(zhì)上扎1小穴，將苗栽入，覆好基質(zhì)。將移栽好小苗的植苗盤(pán)置于塑料膜大棚內(nèi)，每天適量灑水，保持空氣濕度，并適時(shí)打開(kāi)通風(fēng)口換氣(圖1：12)；30 d后正常田間管理。為了促進(jìn)苗的健壯和生長(zhǎng)速度，可采用1/4 MS營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行葉面噴灑。

3 討論

目前，有關(guān)白及的種子萌發(fā)與白及組織培養(yǎng)研究已有不少的報(bào)道。管常東等[10]綜合了2010年前有關(guān)白芨的組培快繁育苗技術(shù)研究進(jìn)展；張燕等[12]研究報(bào)道了白芨種子在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)過(guò)程和幼苗形成的形態(tài)學(xué)特征。但尚無(wú)白及種子直接試管高頻萌發(fā)技術(shù)的應(yīng)用報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，1/2 MS、MS培養(yǎng)基及添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和不同培養(yǎng)環(huán)境對(duì)白及種子萌發(fā)誘導(dǎo)存在差異；光照和溫度對(duì)白及種子試管萌發(fā)有明顯的影響。適宜白及種子試管高頻萌發(fā)的環(huán)境為光環(huán)境，且添加活性炭有利于促進(jìn)白及種子的萌發(fā)，此結(jié)果與葉靜等[11]認(rèn)為活性炭有利于促進(jìn)白及種子萌發(fā)研究結(jié)果相似。篩選的白及種子試管高頻萌發(fā)的誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 1 mg·L-1+AC 6 g·L-1，而適合白及試管壯苗生根及小鱗莖生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基。

白及不僅藥用價(jià)值高，而且具觀賞價(jià)值，是我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原材料。隨著我國(guó)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，白及的臨床應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，藥用需求也急劇增加。由于白及種子非常細(xì)小且無(wú)胚乳，在自然條件下萌發(fā)困難，繁殖效率低。目前人工種植種群擴(kuò)大的主要方式為分株繁殖[17]，但形成商品需3～5年，自然增長(zhǎng)率遠(yuǎn)低于市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)。優(yōu)質(zhì)種源是制約人工種植白及的瓶頸，所以開(kāi)展白及種子的試管萌發(fā)研究，提供一種簡(jiǎn)單、快速、成本低、應(yīng)用性強(qiáng)的白及種子試管高頻萌發(fā)技術(shù)很有必要，可保障優(yōu)質(zhì)種苗供給，從而推動(dòng)白及規(guī)?；N植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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StudyonEfficientSeedGerminationofBletillastriatainvitro

SONG Xiaodan，CHENXiaoling，SHANGLi，YANGPeijun*

(SchoolofBiologicalSciencesandEngineering，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，China)

Objective：To study the suitable culture conditions for efficient seed germination ofBletillastriatain vitro and seedling growth，and to obtain a large number of seedlings.Methods：Using mature fruits ofB.striatatreated by surface disinfection，seed and seedlings were cultured on MS media with different components.Results：The suitable conditions for efficient seed germinating were to culture under light on MS+NAA 1.0 mg·L-1+AC 6.0 g·L-1.Under this condition，germination rate reached more than 98%；1/2 MS medium was suitable for shoot growing and rooting culture.Rooting rate was up to 95%.Transplanting survival rate was 85% on average.Conclusion：There were a few of tissue culture research reports onB.striata，but this results provided a simple，rapid and practical technology for seed germination ofB.striatain vitro，helping to promote the large-scale artificial planting.

Bletillastriata；Seed；Germination in vitro

2014-05-12)

國(guó)家中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(xiàng)(201207002)，大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(UIRP12020)

*

楊培君，教授，研究方向：植物生物技術(shù)研究；E-mail：yang@snut.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.09.010