正交試驗(yàn)法優(yōu)選咖啡渣中脂肪酸的提取工藝△

李永輝，譚銀豐，張俊清*，廖小平*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571199)

中藥工業(yè)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選咖啡渣中脂肪酸的提取工藝△

李永輝1，2，譚銀豐1，2，張俊清1，2*，廖小平1，2*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

目的：優(yōu)選咖啡渣中脂肪酸的提取工藝。方法：以提取物中總脂肪酸的得率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)化脂肪酸的提取工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳提取工藝為8倍量的丙酮提取3次，每次3 h，所得脂肪酸得率為17.06%。結(jié)論：優(yōu)選的工藝提取效率高、結(jié)果穩(wěn)定，為咖啡渣中脂肪酸類成分的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

咖啡渣；脂肪酸；正交試驗(yàn)

咖啡樹(shù)屬于茜草科(Rubiaceae)植物，主要為阿拉比卡種Coffea Arabica和羅布斯塔種Coffea Robusta/Coffea Canephora，通常為喬木或灌木，生長(zhǎng)于熱帶非洲和印度洋島嶼，在我國(guó)主產(chǎn)于海南和云南等熱帶亞熱帶地區(qū)，其果實(shí)咖啡豆是生產(chǎn)咖啡飲料的主要原料[1]。咖啡渣是咖啡飲品在加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其重量約占咖啡豆的2/3，咖啡生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的咖啡渣[2]，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。研究表明咖啡渣中含有較豐富的油脂、糖類和蛋白質(zhì)等成分，其中油脂類成分的含量高達(dá)14%以上，在咖啡加工過(guò)程中主要?dú)埓嬖诳Х仍卸粡U棄。研究表明咖啡渣中油脂類成分主要包括棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸4種脂肪酸[3]，其中不飽和脂肪酸亞油酸和油酸的含量占咖啡渣油脂成分的2/3左右，不飽和脂肪酸具有抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、降低糖尿病并發(fā)癥等多種藥理功效[4-7]。因此，充分挖掘和利用咖啡渣廢棄物中的脂肪酸類成分，實(shí)現(xiàn)廢物的再利用，開(kāi)發(fā)具有保健治療作用的健康食品或藥品，具有重要實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

目前咖啡油的提取工藝報(bào)道較少，主要是采用索氏抽提法，連續(xù)提取8 h才能達(dá)到最佳提取率[8]。由于提取工藝繁瑣、提取時(shí)間長(zhǎng)，難以實(shí)施產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，制約了咖啡渣中油脂的資源化利用。筆者在前人研究基礎(chǔ)上，針對(duì)咖啡渣中的脂肪酸類成分，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為咖啡渣中脂肪酸類成分的工業(yè)化生產(chǎn)提供可行的方法；并運(yùn)用氣相色譜法對(duì)咖啡渣中脂肪酸類成分進(jìn)行定量分析，為咖啡渣中脂肪酸類成分的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

咖啡渣由?？诹ι窨Х蕊嬈酚邢薰咎峁藐帥鎏幜栏杉吹?。

棕櫚酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190029-201202)，十七烷酸(內(nèi)標(biāo)，Merck公司，99%)，15%三氟化硼(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：201302161)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-W420三用恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；RE-R52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；GC-14C氣相色譜儀(島津公司)；XS105 Dual Range分析天平(梅特勒托利多公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 咖啡渣總脂肪酸的含量測(cè)定方法

2.1.1 咖啡渣脂肪酸樣品的制備 精密稱取咖啡渣樣品約20.0 g，加入不同量的丙酮溶劑，按照表1中正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求進(jìn)行提取，提取液50 ℃減壓濃縮至小體積，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中蒸發(fā)至干，即得咖啡渣脂肪酸樣品。

2.1.2 對(duì)照品和脂肪酸樣品的甲酯化 精密稱取棕櫚酸對(duì)照品或咖啡渣脂肪酸提取物適量，置50 mL圓底燒瓶中，加入十七烷酸內(nèi)標(biāo)約10 mg、2 mo1·L-1的氫氧化鉀甲醇溶液4 mL，接上冷凝管，置85 ℃水浴上加熱，并使溶液沸騰，5 min后從冷凝管頂部加入15%的三氟化硼-甲醇溶液5 mL，繼續(xù)沸騰2 min，再?gòu)睦淠茼敳考尤氕h(huán)己烷2 mL，繼續(xù)沸騰1 min。取下冷凝管，加入飽和氯化鈉溶液，至液面接近瓶口，取上層有機(jī)層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，即得對(duì)照品甲酯化溶液或脂肪酸樣品甲酯化溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：高純氮?dú)猓涣魉伲?.0 mL·min-1；分流比：50∶1；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；程序升溫：160 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1升至280 ℃，保持5 min；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)器：FID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度：250 ℃。在該條件下，咖啡渣中脂肪酸可以基本實(shí)現(xiàn)基線分離，且內(nèi)標(biāo)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.棕櫚酸甲酯 2.十七烷酸甲酯(內(nèi)標(biāo))A.對(duì)照品 B.供試品(不含內(nèi)標(biāo)) C.供試品(含內(nèi)標(biāo))圖1 脂肪酸提取物及對(duì)照品GC圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取棕櫚酸對(duì)照品約10，15，30，60，90，120 mg，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下進(jìn)行甲酯化后依法測(cè)定，以棕櫚酸與十七烷酸的質(zhì)量比Mi/Ms為橫坐標(biāo)(X)，棕櫚酸甲酯與十七烷酸甲酯的峰面積比Ai/As為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。得棕櫚酸的回歸方程為Y=1.669 9X-1.003 2(r=0.999 1)，表明棕櫚酸在質(zhì)量比0.99～12.64呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取棕櫚酸對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算棕櫚酸與十七烷酸的峰面積比，計(jì)算RSD=1.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取放置了1，2，4，6，8，12 h的咖啡渣脂肪酸樣品溶液，測(cè)定棕櫚酸與十七烷酸的峰面積比，計(jì)算RSD=1.81%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 樣品測(cè)定 在上述色譜條件下，吸取供試品溶液1 μL，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸的峰面積和，以峰面積和與十七烷酸的比值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品中總脂肪酸的含量。

2.2 正交試驗(yàn)

精密稱取咖啡渣9份，每份20.0 g，以丙酮進(jìn)行提取。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，選擇溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素[9-10]，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以提取物量和總脂肪酸量為指標(biāo)，考察不同因素水平對(duì)咖啡渣中脂肪酸提取率的影響。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3和表4。

表1 咖啡渣中脂肪酸提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表2 咖啡渣中脂肪酸提取工藝正交試驗(yàn)

表3 咖啡渣中提取物量方差分析

注：(1)n=2，(2)F(2，2)=19.0；下同

表4 咖啡渣中總脂肪酸量方差分析

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析可知，以提取物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其最佳提取工藝條件為A2B2C3，各因素的影響順序?yàn)镃>A>B。以總脂肪酸提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其最佳提取工藝條件為A1B3C3，各因素的影響順序?yàn)镃>B>A。表3、4方差分析結(jié)果表明C因素對(duì)提取物量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B和C因素對(duì)總脂肪酸量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合上述分析，結(jié)合實(shí)際情況，確定方案A1B3C3為最佳提取工藝條件，即用8倍量的丙酮，提取3次，每次3 h。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了考察優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定性，另取咖啡渣樣品3份，每份20.0 g，加8倍量的丙酮，提取3次，每次3 h，分別測(cè)定總脂肪酸含量，計(jì)算脂肪酸得率。結(jié)果表明3份提取物中平均得到的脂肪酸量為3.412 g，得率為17.06%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相差不大，表明采用優(yōu)選的工藝參數(shù)進(jìn)行提取，其總脂肪酸含量較高，且工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

對(duì)咖啡渣中脂肪酸類成分的提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，分別選用了95%工業(yè)乙醇、丙酮提取法和超臨界CO2萃取法進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示工業(yè)乙醇和超臨界萃取法對(duì)咖啡渣中脂肪酸的萃取率比較接近，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于丙酮的萃取率，僅為丙酮萃取的60%左右。因此選擇丙酮作為咖啡渣中脂肪酸類成分的較佳提取溶劑。在提取評(píng)價(jià)時(shí)，綜合考慮提取物得到的提取物量和總脂肪酸量。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)咖啡渣脂肪酸樣品的甲酯化產(chǎn)物進(jìn)行了GC-MS鑒定。結(jié)果顯示4個(gè)脂肪酸化合物分別為棕櫚酸甲酯(tR=16.0)、十七烷酸甲酯(tR=18.4)、亞油酸甲酯(tR=20.0)、油酸甲酯(tR=20.1)和硬脂酸甲酯(tR=20.7)。按照最佳提取條件，提取物中4種脂肪酸的含量占總提取物的64.3%(g/g)，顯示提取物中脂肪酸含量較高。

脂肪酸的含量測(cè)定一般采用GC法[11-12]，實(shí)驗(yàn)中采用棕櫚酸作為對(duì)照品對(duì)4種脂肪酸進(jìn)行了整體定量，其結(jié)果會(huì)有一定的誤差。然而考慮到其結(jié)果對(duì)工藝研究影響較小，未進(jìn)行多指標(biāo)定量。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中亞油酸甲酯和油酸甲酯未獲得基線分離，作者曾經(jīng)嘗試降低梯度升溫速率，試圖獲得更好的分離效果。然而當(dāng)梯度速率降低至0.5 ℃·min-1時(shí)，分離效果仍未有明顯改善，考慮到分離效果對(duì)工藝研究影響較小，因此最終采用了4 ℃·min·的升溫速率。

實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的工藝提取效率高、結(jié)果穩(wěn)定，為咖啡渣中脂肪酸類成分的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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Optimization of Extraction Process of Total Fatty Acids from Coffee Residue by Orthogonal Test Design

LI Yonghui1，2，TAN Yinfeng1，2，ZHANG Junqing1，2*，LIAO Xiaoping1，2*

(1.HainanprovincialkeylaboratoryofR&Dontropicalherbs，Haikou571199，China； 2.SchoolofPharmacy，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China)

Objective：To optimize the best of fatty acids extraction methods from coffee residue.Methods：The best extraction method was investigated using the yields of total fatty acids and optimized through orthogonal test design.Results：The conditions with highest fatty acids yield were obtained as follows：the extraction solvent was acetone，the ratio of material-solvent was set 1∶8 (m/v)，extracting for 3 times with 3 hour each time.Under these conditions the yield of total fatty acids can reach 17.06% (g/g).Conclusion：The optimized extraction method was high efficiency and stable，can provide some reference for the industrialization of fatty acids in coffee residue.

Coffee residue；Fatty acids；Orthogonal test design

海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)(2011SF012)，海口市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-54)

*[通信作者] 張俊清，教授，博士，研究方向：新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，E-mail：jqzhang2011@163.com；廖小平，教授，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：249765241@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.012

2013-05-20)