紅花藥材中非法染有酸性紅73的TLC鑒別和HPLC確證

楊榮艷，宋瑩，李本淳

(吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000)

紅花藥材中非法染有酸性紅73的TLC鑒別和HPLC確證

楊榮艷*，宋瑩，李本淳

(吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000)

目的：建立紅花藥材中非法染有酸性紅73的檢測(cè)方法。方法：采用TLC對(duì)紅花中非法染有酸性紅73進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC確證建立的TLC可行。結(jié)果：在TLC中，陽(yáng)性樣品可檢出與酸性紅73對(duì)照試劑位置和顏色一致的斑點(diǎn)；HPLC中，也出現(xiàn)了與對(duì)照試劑保留時(shí)間一致的色譜峰，并且DAD檢測(cè)器檢驗(yàn)，在420～580 nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見(jiàn)吸收光譜相同。結(jié)論：該方法前處理簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于紅花藥材中非法染有酸性紅73的檢查。

紅花；酸性紅73；薄層色譜法；高效液相色譜法

紅花收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部，檢驗(yàn)項(xiàng)目有性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分檢查、雜質(zhì)檢查、總灰分檢查、酸不溶性灰分檢查、吸光度檢查、浸出物和含量測(cè)定[1]?！端幤窓z驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件(編號(hào)2007009)》[2]中補(bǔ)充了紅花金橙Ⅱ檢查項(xiàng)。在2012年度藥品抽驗(yàn)中，筆者按照《中國(guó)藥典》2010年版一部對(duì)20批紅花進(jìn)行薄層鑒別檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有3批紅花供試品色譜比對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上多一個(gè)紅色斑點(diǎn)，并對(duì)此斑點(diǎn)的成分進(jìn)行了研究，初步確認(rèn)為酸性紅73。酸性紅73是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，被國(guó)家禁止用于食品中的工業(yè)染料，威脅患者的健康[3]。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立薄層色譜定性鑒別和高效液相色譜確證紅花中非法染有酸性紅73的方法，為藥品監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010CHT型高效液相色譜儀(島津)，紫外檢測(cè)器和DAD檢測(cè)器，CLASS-VP色譜工作站，UV-2450可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)，BP211D型電子分析天平，LC-250超聲清洗器(功率250 W，頻率50 kHZ)；純水器(德國(guó))。

1.2 試藥

酸性紅73對(duì)照試劑(美國(guó)AccuStandard公司，供含量測(cè)定用，批號(hào)：16675)；色譜甲醇，自制超純水，醋酸銨、乙醇均為分析純，市售硅膠G板(上海盛亞化工有限公司，批號(hào)：20090306)。

紅花(市售)，紅花對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120907-201111)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[4]

取本品1 g，加70%乙醇20 mL，超聲提取20 min，取上清液作為供試品溶液。另取酸性紅73對(duì)照試劑適量，分別加70%乙醇溶解并制成每1 mL含60 μg的溶液，作為對(duì)照試劑溶液。照《中國(guó)藥典》2010年版一部薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照試劑溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水(1∶3∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在可見(jiàn)光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照試劑色譜相應(yīng)的位置上，不顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照不干擾測(cè)定。見(jiàn)圖1。

1～3.供試品 4.酸性紅73對(duì)照試劑 5.紅花對(duì)照藥材圖1 紅花及對(duì)照品TLC圖

2.2 HPLC測(cè)定酸性紅73(紫外檢測(cè)器)

2.2.1 色譜條件[5-6]色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.025 mol·L-1醋酸銨溶液，甲醇梯度洗脫條件：20%～45%(0～8 min)，45%～80%(8～20 min)；流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：508 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 酸性紅73對(duì)照試劑12 mg，精密稱(chēng)定，置200 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，即得(每1 mL含酸性紅73對(duì)照試劑60 μg)。

2.2.3 供試品溶液的制備[5，7]取本品約1 g，加70%乙醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取不含有酸性紅73的紅花對(duì)照藥材作為陰性樣品，按照2.2.3供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 把供試品溶液、陰性樣品溶液和酸性紅73對(duì)照試劑分別注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果供試品色譜圖中，供試品主峰保留時(shí)間與酸性紅73對(duì)照試劑主峰保留時(shí)間一致；陰性樣品色譜圖中，在與酸性紅73對(duì)照試劑主峰保留時(shí)間處無(wú)峰出現(xiàn)。見(jiàn)圖2。

A.酸性紅73對(duì)照試劑 B.供試品 C.紅花對(duì)照藥材圖2 紅花及對(duì)照品HPLC圖

2.2.6 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密稱(chēng)取酸性紅73對(duì)照試劑(含量測(cè)定用)10.10 mg，置100 mL容量瓶中，加用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后的70%乙醇適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照試劑溶液儲(chǔ)備液。

精密量取對(duì)照試劑溶液儲(chǔ)備液0.1，0.5，1，2，3，6，8，10 mL分別置10 mL量瓶中，用上述70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為1.01，5.05，10.10，20.20，30.30，60.60，80.80，100.10 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。不經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，分別將上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL注入高效液相色譜儀分析測(cè)定，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，取3次平均值，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，經(jīng)線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=30 393X-2 583.8，r=1.000。結(jié)果表明，酸性紅73在1.01～100.10 μg·mL-1具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一質(zhì)量濃度(60 μg·mL-1)對(duì)照品溶液按上述色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積RSD=0.34%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，考察了0，2，4，8，12，16，24 h峰面積值的變化，結(jié)果峰面積RSD=1.18%(n=6)，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品12份，共分為2組，每份1.0 g，精密稱(chēng)定，精密加入70%乙醇20 mL，照2.2.3方法制備，獨(dú)立試驗(yàn)，結(jié)果第一組中酸性紅73的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40 mg·g-1，RSD=5.12% (n=6)；第二組中酸性紅73的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.48 mg·g-1，RSD=8.03%(n=6)。

2.2.10 陰性樣品回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取紅花對(duì)照藥材樣品6份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照試劑溶液10 mL(60 μg·mL-1)，再分別精密加入70%乙醇10 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理20 min，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾頭(用待過(guò)濾液4 mL使濾頭充分飽和)過(guò)濾，進(jìn)樣量10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，即得。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表3 紅花陰性樣品回收率試驗(yàn)

注：樣品中含酸性紅73的量均為0 mg，酸性紅73對(duì)照試劑加入量均為0.600 0 mg

2.2.11 方法的檢測(cè)限 按照正文色譜條件，基線(xiàn)走穩(wěn)后，進(jìn)一針10 μL溶劑，再分別將質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.3 μg·mL-1的對(duì)照試劑各10 μL注入高效液相色譜儀，結(jié)果0.3 μg·mL的對(duì)照試劑信噪比S/N=3，所以將方法的檢測(cè)限定為0.3 μg·mL-1。

2.2.12 樣品測(cè)定 照上述色譜條件和制備方法，依法測(cè)定3批市售紅花樣品，分別測(cè)定3次，3批樣品中酸性紅73的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.45，0.71，0.86 mg·g-1。

2.3 高效液相色譜法DAD檢測(cè)器確證

2.3.1 色譜條件、供試品和對(duì)照品試劑的制備 DAD檢測(cè)器，其他條件同2.2.1；供試品和對(duì)照品試劑的制備分別同2.2.2和2.2.3。

2.3.2 高效液相色譜法DAD檢測(cè)器檢驗(yàn) 供試品色譜中，出現(xiàn)與對(duì)照試劑保留時(shí)間一致的色譜峰。采用二極管陣列檢測(cè)器比較相應(yīng)色譜峰在420～580 nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，發(fā)現(xiàn)吸收光譜相同。見(jiàn)圖3～6。

圖3 酸性紅73對(duì)照試劑光譜

圖4 酸性紅73對(duì)照試劑色譜

圖5 紅花供試品光譜

圖6 紅花供試品色譜

3 討論

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩組重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果RSD值均大于3.0%，為此考察了樣品粉碎與否對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不粉碎的樣品含量高于粉碎樣品的含量，樣品處理得越細(xì)，含量越低，而且含量也不均勻?？紤]到酸性紅73是一種著色劑，一般情況下都會(huì)附著在樣品的表面，所以采取不粉碎處理樣品。

另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的對(duì)照試劑溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾頭過(guò)濾后，峰面積與濃度比不成正比，考慮到可能是微孔濾頭對(duì)酸性紅73具有吸附作用。我們采用同濃度對(duì)照試劑溶液，通過(guò)過(guò)濾和未過(guò)濾來(lái)驗(yàn)證是否具有吸附作用，考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過(guò)濾的對(duì)照試劑的峰面積是經(jīng)過(guò)濾的對(duì)照試劑的峰面積的1.2倍，損失率約占16%?？紤]到每次用濾頭過(guò)濾供試品溶液時(shí)，其對(duì)供試品溶液中酸性紅73吸附程度不同，從而導(dǎo)致供試品含量不確定。上述結(jié)果說(shuō)明樣品本身的均勻性差和酸性紅73的吸附性是影響重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的原因。實(shí)驗(yàn)方法只是針對(duì)非法染有色素酸性紅73的紅花樣品檢查，并非含量測(cè)定項(xiàng)，雖然RSD超出3.0%，但并不影響方法的應(yīng)用。

通過(guò)12份樣品的重復(fù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅花樣品中酸性紅73的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.38～0.52 mg·g-1，表明樣品本身的均勻性很差，如采用樣品加標(biāo)，無(wú)法得到準(zhǔn)確的回收率結(jié)果，所以我們采取陰性樣品加標(biāo)進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果RSD=0.14%，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的要求，說(shuō)明此檢驗(yàn)方法可行。

考察了shimpack C18、zorbax SB C18、Agilent TC-C183種色譜柱，結(jié)果都能得到很好的色譜分離。另外，考察了流動(dòng)相中醋酸銨溶液的兩種濃度即0.025，0.05 mol·L-1，結(jié)果都能達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，但是考慮到含高濃度鹽的流動(dòng)相對(duì)色譜柱傷害較大，所以采用0.025 mol·L-1醋酸銨溶液。

實(shí)驗(yàn)建立的檢驗(yàn)方法前處理簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于紅花藥材中非法染有酸性紅73的檢查，研究為紅花監(jiān)管提供技術(shù)支持。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：141-142.

[2] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件匯編(2003～2008年)[S].2007：154.

[3] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局稽查局.五味子補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件[S].2007

[4] 閔春艷，付凌燕，汪祺，等.紅花藥材摻偽染色檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥事，2011，(8)：772-775.

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[7] 汪建君，陳惠玲.HPLC-PDA法檢測(cè)正天丸和正天膠囊中6種非法添加色素[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2013，(1)：51-53.

TLCHPLCIdentificationofillegallystainedAcidRed73inCarthamiFlos

YANG Rongyan*，SONG Ying，LI Benchun

(SipingInstituteforDrugandFoodControl，Siping136000，China)

Objective：To establish TLC identification and HPLC confirmatory method for illegally stained Acid Red 73 in Carthami Flos.Methods：TLC was employed to identify Acid Red 73，which was confirmed with HPLC.Results：In TLC，the emergence of Acid Red 73 with a consistent position and color spots.In HPLC，the emergence of the peak retention time，and comparing the wavelength range of 420-580 nm UV-visible absorption spectrum by a DAD detector，the same absorption spectrum was found.Conclusion：The method is easy，quick and accurate，can be used to identify Acid Red 73 in Carthami Flos.

Carthami Flos；Acid Red 73；TLC；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.005

2013-09-12)

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楊榮艷，碩士，主管藥師，研究方向：中藥檢驗(yàn)；E-mail：yry_lg@126.com