鹽酸甲醇溶液提取氣相色譜質(zhì)譜法測定水生動(dòng)植物樣品丁基錫

肖小雨+賀根和+尹麗+黃翔峰

摘要采用四乙基硼酸鈉（NaBEt4）為衍生劑，建立簡單、高效的生物樣品有機(jī)錫氣相質(zhì)譜（GCMS）分析方法。結(jié)果表明，冷凍干燥生物樣品粉末0.1 g經(jīng)15 mL 0.035 mol/L鹽酸甲醇振蕩提取1 h，定量提取液加入乙酸鹽緩沖溶液（pH 4.8） 調(diào)節(jié)溶液酸度，用含內(nèi)標(biāo)物正己烷2 mL和0.5 mL 2%（m/V）NaBEt4水溶液衍生萃取30 min后，GCMS同時(shí)測定一丁基錫（ MBT）、二丁基錫（DBT）、三丁基錫（TBT）。在0.5～50 μg/L范圍內(nèi)，線性良好，3種有機(jī)錫加標(biāo)回收率均在80%以上。此方法能快速簡單對(duì)復(fù)雜生物樣品中的有機(jī)錫進(jìn)行分析，其檢出限約為0.01 μg/L，3個(gè)平行樣測量值標(biāo)準(zhǔn)偏差都在10%以內(nèi)。

關(guān)鍵詞鹽酸甲醇溶液； 丁基錫； 氣相色譜質(zhì)譜； 水生動(dòng)植物

1引言

有機(jī)錫化合物（OTCs）作為聚氯乙烯（PVC）穩(wěn)定劑，農(nóng)業(yè)殺蟲劑，船體、海洋建筑以及鉆井平臺(tái)等的防污涂料已經(jīng)在全世界范圍得到廣泛使用＼[1＼]。然而，OTCs在防污防害的同時(shí)，也對(duì)環(huán)境中的非目標(biāo)生物造成急性或者潛在的危害，尤其以生物殺滅劑三丁基錫（TBT）危害最為嚴(yán)重＼[1～3＼]。研究發(fā)現(xiàn)，TBT不僅毒性大，而且能干擾生物體內(nèi)荷爾蒙的合成、分泌、輸送等過程，進(jìn)而影響生物體的正常生長、發(fā)育和繁殖等生命活動(dòng)＼[4～7＼]，給人類的健康生活帶來潛在的危害。

目前，生物樣品有機(jī)錫分析的方法已經(jīng)有較多報(bào)道＼[8～12＼]，且主要以氣相色譜技術(shù)為主，但是該分析方法要經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜的前處理過程，主要包括提取、凈化、衍生和萃取等4個(gè)過程＼[1，2＼]，該復(fù)雜過程不僅耗時(shí)而且容易造成較大誤差。為了更加有效地減小誤差，使整個(gè)分析操作過程更加簡單和快捷化，本實(shí)驗(yàn)以鹽酸甲醇溶液為提取劑，提取凍干生物樣品OTCs，然后直接用NaBEt4衍生劑和正己烷萃取劑對(duì)提取液同時(shí)衍生萃取，省去了傳統(tǒng)方法的中凈化步驟，建立水生植物樣品中丁基錫化合物GCMS測定方法。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1儀器、試劑與材料

5975C質(zhì)譜儀（配EI源）、7890A氣相色譜儀（美國Agilent 公司）；6870液氮冷凍研磨機(jī)（美國TKISPEX 公司）； FD2C真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）； KQ2200 B 超聲清洗器（ 上海昆山公司）； pHS3C酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）； BS224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）； 聚四氟乙烯試管。所有玻璃儀器及試管在使用前都經(jīng)過10%HNO3浸泡過夜，然后流水洗凈，最后再用蒸餾水或純凈水洗干凈，烘干備用。

三丁基錫 （TBT），二丁基錫 （DBT），一丁基錫（MBT）和四丁基錫（TEBT），均購自上海SigmaAldrich公司，純度均大于96%；甲醇、正己烷（HPLC級(jí)，美國Tedia公司）；四乙基硼化鈉（NaBEt4，純度>98%，上海百靈威科技有限公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

小鯉魚購自吉安花鳥市場，沉水植物金魚藻取自贛江吉安段某支流，兩種生物樣品用去離子水和超純水沖洗干凈，在超低溫冰箱中冷凍24 h，冷凍干燥72 h。碾磨粉碎，過100目孔徑篩，標(biāo)記后放干燥器備用。

2.2溶液配制

用甲醇溶液分別配制濃度為1.0 g/L的TBT，DBT，MBT標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（TEBT使用正己烷配制），濃度以無機(jī)錫元素濃度計(jì)。根據(jù)需要，分別移取上述有機(jī)錫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制相應(yīng)濃度的有機(jī)錫標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并于冰箱中4 ℃黑暗保存不超過1星期。

配制0.035 mol/L HCl甲醇溶液、2%（m/V）NaBEt4溶液、3%（m/V）KOH溶液及相關(guān)緩沖溶液，其中NaBEt4溶液新鮮配制，并且在24 h內(nèi)使用。

2.3樣品前處理

2.3.1生物樣品加標(biāo)萃取準(zhǔn)確稱取0.1 g干燥生物樣品于30 mL的特氟龍樣品管中，分別加入25 ng和50 ng丁基錫混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL，樣品管加蓋密封吸附平衡后，分別用10 mL 0.035 mol/L鹽酸甲醇溶液和5 mL 3% （m/V）KOH溶液，振蕩萃取60 min，轉(zhuǎn)速300 r/min，以6500 r/min離心15 min，取上清液，用0.45 μm聚四氟乙烯濾膜（空白及前期研究結(jié)果＼[13＼]表明該材質(zhì)對(duì)有機(jī)錫不吸附）過濾后備用。同時(shí)增加OTCs的空白樣品，所有樣品做3組平行。

2.3.2生物樣品萃取取在實(shí)驗(yàn)室富集初始濃度為3 μg/L TBT 5天的小鯉魚和金魚藻。3組平行生物樣進(jìn)行有機(jī)錫含量測定。

.4OTCs的衍生和萃取

參考文獻(xiàn)＼[11＼]關(guān)于OTCs在植物樣品的衍生和萃取方法及文獻(xiàn)＼[8＼]關(guān)于OTCs在魚類生物樣品的衍生和萃取方法。本實(shí)驗(yàn)選取NaBEt4為衍生劑，正己烷為萃取劑，具體步驟為：5 mL OTCs提取液加入到裝有40 mL 緩沖溶液的100 mL容量瓶中，然后再加入0.5 mL 2% NaBEt4溶液和2 mL含50 ng TEBT內(nèi)標(biāo)物的正己烷，加蓋密封搖勻后恒溫25 ℃條件下機(jī)械振蕩 30 min，轉(zhuǎn)速為300 r/min，取出后加純凈水至容量瓶瓶頸（不溢出），靜置分層后取上層有機(jī)相進(jìn)入GCMS分析。OTCs水樣的衍生萃取步驟與生物樣類似。

2.5GCMS測定

色譜柱：DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為 250 ℃； 進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣，速度為100 mL/min，載氣為氦氣，EI=70 eV； 柱溫箱升溫程序?yàn)椋?0 ℃（2 min）25 ℃/min230 ℃（2 min）； 柱流速控制模式為恒流，流速1 mL/min ； 初始?jí)毫?1.85 kPa； 進(jìn)樣量為1.0 μL。質(zhì)譜離子

[FQ（92＼.292，Y-WZ][HJ*4]表1GCMS分析丁基錫的保留時(shí)間與SIM選擇條件

Table 1Retention time and SIM factors of butyltin compounds by GCMS

[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK14，WK8，WK16W]丁基錫Butyltin保留時(shí)間Retention time

（min）定量與定性離子Qualitative ion and quantitative ion

（m/z）三丁基錫 Tributyltin， TBT10.20263*， 207， 291二丁基錫 Dibutyltin， DBT8.92263*， 207， 261一丁基錫 Monobutyltin， MBT7.41179*， 235， 233四丁基錫 Tetrabutyltin， TEBT11.28179*， 177， 233[BHDFG12，WKZQ0W]* 定量離子（Quanlitative ion）。[BG）W][HT5][HJ]

源溫度：250 ℃； 接口溫度：280 ℃； 溶劑延遲時(shí)間為6 min； 質(zhì)譜檢測模式為選擇離子模式（SIM），各丁基錫的保留時(shí)間和定量、定性離子見表1。

3結(jié)果與討論

3.1衍生化條件的優(yōu)化

3.1.1pH對(duì)OTCs衍生化的影響NaBEt4是大多數(shù)研究者首選的OTCs衍生試劑，它已成功用于水樣、生物樣、沉積物、土壤、木材以及其它物質(zhì)中不同形態(tài)甲基錫、丁基錫、苯基錫、環(huán)己基錫等有機(jī)錫化合物的測定＼[6，10，12，14，15＼]。為了解pH值（pH 2.0，4.8，7.0，8.0和10.0）＼[12＼]對(duì)NaBEt4衍生劑的衍生效果的影響， 0.5 mL 2% NaBEt4溶液＼[9＼]分別對(duì)含10 ng丁基錫混標(biāo)物的水溶液衍生效率，各種OTCs在不同pH值下經(jīng)衍生萃取分析所得的GCMS峰面積強(qiáng)度如圖1所示。從圖1可見，所有水樣中加標(biāo)OTCs的最大峰面積均發(fā)生在pH 4.8，但是內(nèi)標(biāo)物TEBT在兩組混標(biāo)物中峰面積響應(yīng)值相當(dāng)，而且?guī)缀醪浑SpH值變化， 這主要是因?yàn)槠洳恍柩苌涂梢灾苯颖籊CMS檢測。這些結(jié)果表明，pH值對(duì)OTCs的衍生效率的影響較大，衍生和萃取效果整體上是隨pH值的增大而先增大后減小，這與文獻(xiàn)[1，9，16]的結(jié)果一致。因此，綜合考慮各OTCs的衍生效率，本實(shí)驗(yàn)選擇1 mol/L醋酸鹽緩沖溶液（pH 4.8）作為生物樣品中有機(jī)錫化合物萃取衍生緩沖溶液。

3.1.2衍生和萃取時(shí)間的影響在上述選出的pH緩沖溶液（pH 4.8）條件下，繼而研究衍生和萃取時(shí)間對(duì)NaBEt4衍生效率的影響，10 mL 1 μg/L的丁基錫混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入40 mL pH 4.8緩沖溶液中，然后再分別加入0.5 mL 2% NaBEt4溶液和1 mL含10 ng內(nèi)標(biāo)TEBT的正己烷溶液同時(shí)進(jìn)行衍生和萃取。依據(jù)文獻(xiàn)＼[8＼]報(bào)道，當(dāng)衍生萃取反應(yīng)超過60 min，所有OTCs的電信號(hào)強(qiáng)度能基本維持不變，因此，本實(shí)驗(yàn)條件下，分別考察了反應(yīng)10，30，60 和120 min時(shí)有機(jī)錫的衍生萃取回收效率，結(jié)果如圖2所示。從圖2發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，所有OTCs的回收率都能達(dá)到80%以上，尤其是TBT和DBT，其回收率基本達(dá)到100%。但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增加到60 min，甚至120 min，各OTCs回收率增加量不超過2%，因此，在保證分析準(zhǔn)確的情況下，為了減少操作時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)最終選取衍生化時(shí)間為3.2酸堿提取法對(duì)添加OTCs樣品回收率比較

生物樣品中OTCs常用的方法是酸提取法＼[10～12＼]和堿提取法＼[9＼]，并通常以超聲、機(jī)械振蕩等輔助手段增加提取效率。因此，本研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，首先選取對(duì)魚和植物樣均有良好提取效果的鹽酸甲醇溶液對(duì)凍干樣品加標(biāo)OTCs進(jìn)行提取，然后依據(jù)前面獲得的衍生和萃取條件進(jìn)行分析，結(jié)果列于表2。從表2可知，當(dāng)0.1g生物樣品中分別添加25和50 ng的OTCs，3組平行樣中各OTCs加標(biāo)回收率的平均值都能達(dá)到80.0%以上，而且OTCs兩個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率基本一致。但是，不同OTCs之間，其回收率略有差別，其中以一取代有機(jī)錫的回收率最低。如在魚樣中，TBT和DBT的回收率平均值在96.4%～105.0%，而MBT僅在81.0%左右； 相同的變化規(guī)律也能在金魚藻樣品中發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果與Carlierpinasseau等關(guān)于OTCs在淡水白鮭＼[10＼]和Simon等關(guān)于OTCs在水生植物伊樂藻＼[11＼]的研究結(jié)果基

6.2[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT5][HJ]

本一致，而化合物本身的理化特性差異（如其在水中的溶解度以及疏水性等）可能是造成OTCs回收率差別的主要原因，其中MBT的溶解度最大，回收率最低。

其次，Tang等＼[9＼]認(rèn)為，富集在魚體上OTCs往往是與魚體各組織強(qiáng)烈結(jié)合在一起，采用強(qiáng)堿溶液將魚類等生物體完全消解，對(duì)測定生物體OTCs含量可能更加準(zhǔn)確，他們的研究結(jié)果表明，以KOH溶液提取標(biāo)準(zhǔn)參考魚樣中TBT，其回收率能達(dá)到83%以上。因此，本實(shí)驗(yàn)在上述文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用3% KOH溶液對(duì)上述加標(biāo)OTCs的魚樣進(jìn)行提取，然后經(jīng)過同樣的萃取衍生和測定步驟，最后所得結(jié)果見表3。從表3可見，KOH溶液對(duì)魚樣中的加標(biāo)OTCs具有很好的回收效果，OTCs兩個(gè)濃度的加標(biāo)回收率均達(dá)80%以上。對(duì)于加標(biāo)為50 ng的凍干魚粉樣品（0.1g），其3組平行樣中TBT，DBT和MBT的加標(biāo)平均回收率分別為103.0%，102.5%和80.7%。這些結(jié)果與酸性提取液的效果類似，因此，兩種方法都可以

[FQ（14＼.272，Y-WZ][HJ*4]表3堿性KOH提取魚粉樣品中丁基錫化合物的加標(biāo)回收率和精密度

生物體直接從水環(huán)境富集OTCs應(yīng)該具有本質(zhì)的差別，而采用這兩種方法同時(shí)對(duì)同一實(shí)際環(huán)境生物樣品有機(jī)錫含量分析的對(duì)比研究還沒有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)分別采用HCl甲醇溶液和KOH對(duì)同一魚樣（0.1 g凍干魚樣）中富集的TBT進(jìn)行提取對(duì)比，并分別依據(jù)本實(shí)驗(yàn)和Tang等＼[9＼]獲得的最佳衍生和萃取條件進(jìn)行衍生和萃取，最后經(jīng)過GCMS分析。結(jié)果表明，兩種方法都能提取出生物體內(nèi)富集的TBT及其相應(yīng)代謝產(chǎn)物DBT和MBT，但是提取效率不一樣。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，對(duì)于TBT來說，鹽酸甲醇提取后的平均值為2.63 μg/g（干重），而KOH提取后的平均值為2.43 μg/g（干重），兩種方法的檢測結(jié)果相當(dāng)（p>0.05）；但是降解產(chǎn)物DBT和MBT在酸性條件下檢出結(jié)果卻是堿性條件下檢出結(jié)果的兩倍或者兩倍以上的關(guān)系，其中DBT平均值分別為0.12和0.043 μg/g（干重），MBT平均值分別為0.029和0.011 μg/g（干重），檢測結(jié)果存在顯著性差異（0.01

3.4線性關(guān)系和檢出限

配制0.5～50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入10 ng內(nèi)標(biāo)物，按照水樣處理方法衍生萃取，最終定容至1.0 mL，然后采用相應(yīng)的GCMS檢測條件分析測定，最后以有機(jī)錫和內(nèi)標(biāo)物的面積比（y）對(duì)有機(jī)錫

[TS（]

和內(nèi)標(biāo)物的濃度比（x）作線性回歸分析，各有機(jī)錫的回歸方程如表4所示。3種物質(zhì)在0.5～50 μg/L范圍內(nèi)線性均良好，回歸系數(shù)R2>0.998。并采用加標(biāo)（10 μg/L）樣品進(jìn)行平行測定，得出各丁基錫的檢出限為0. 01～0.12 μg/L，詳見表4。 4種丁機(jī)錫標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜圖以及鯉魚和金魚藻富集三丁基錫后在酸性條件下的氣相色譜圖分別如圖3（a， b和c），其中圖3（b和c）中檢查到的MBT和DBT均為TBT在動(dòng)植物體內(nèi)的降解產(chǎn)物。

4結(jié)論

生物樣品中有機(jī)錫化合物分析方法一般要經(jīng)過提取、凈化、衍生（氣相分析系統(tǒng)）、萃取和檢測等5個(gè)過程。本研究以0.035 mol/L HCl甲醇溶液提取并配以0.5 mL 2% NaBEt4衍生和1 mL含一定內(nèi)標(biāo)濃度的正己烷萃取生物樣品中有機(jī)錫化合物，最后通過GCMS進(jìn)行定性和定量分析， 0.1 g凍干生物樣品粉末中各種有機(jī)錫化合物的加標(biāo)回收率均能到達(dá)80%以上，最佳衍生pH=4.8，衍生時(shí)間為30 min。此方法不僅省去了傳統(tǒng)生物樣品中凈化的步驟，有效減小了實(shí)驗(yàn)誤差，而且能將衍生和萃取步驟同時(shí)進(jìn)行，使實(shí)驗(yàn)操作簡單、快捷，是一種高效的有機(jī)錫化合物分析方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸甲醇提取液能更加有效地將魚體內(nèi)富集的有機(jī)錫化合物提取出來。

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AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.

KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products

周群芳， 江桂斌， 吳迪靖. 分析化學(xué)， 2001， 29（4）： 453-456

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AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.

KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products

周群芳， 江桂斌， 吳迪靖. 分析化學(xué)， 2001， 29（4）： 453-456

15QI JiaLin， YANG GuiPeng， WANG ZhaoKun， NIU ZengYuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 119-122

戚佳琳， 楊桂朋， 王兆錕， 牛增元. 分析化學(xué)， 2013， 41（1）： 119-122

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AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.

KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products