安徽銅陵酸性礦山環(huán)境中微生物群落構(gòu)成調(diào)查

李旭+謝世鵬+胡聰聰+呂鋮+徐清萌+邢輝

摘 要 生物興趣小組對酸性礦山環(huán)境的微生物群落進(jìn)行了調(diào)查分析，利用FeO、改良NA培養(yǎng)基兩種選擇性培養(yǎng)基從銅陵獅子山尾礦區(qū)采集的酸性礦山廢水和尾砂樣品中分離純化得到8株微生物，通過對其形態(tài)特征觀察和16 S rRNA基因序列分析，得到的8株微生物可分為Acidiphilium、Acidisphaera等5個屬微生物。

關(guān)鍵詞 酸性礦山環(huán)境 微生物培養(yǎng) 調(diào)查

中圖分類號 Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B

1 課題提出

南京師范大學(xué)附屬中學(xué)生物興趣小組利用社會實踐的機會參觀了安徽銅陵獅子山酸性尾礦區(qū)。該尾礦區(qū)是由銅礦開采后丟棄的硫化物礦石等堆積形成的，這些硫化物廢礦石與大氣圈中的水、氧氣接觸后，在一系列的微生物作用下形成酸性礦山廢水（Acid Mine Drainage,AMD）與酸性尾砂，AMD與酸性尾砂構(gòu)成了酸性礦山環(huán)境。酸性礦山環(huán)境具有pH低、硫酸鹽含量高的特點，同時往往還含有大量重金屬離子。AMD一旦排入周圍環(huán)境中，會對河流、湖泊、土壤、地下水等造成嚴(yán)重污染，其中重金屬等有害物質(zhì)還能通過魚類、植物等從食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康。

酸性礦山環(huán)境形成后，周圍的生態(tài)環(huán)境往往需要上百年時間才能恢復(fù)，目前采用的治理方法主要是物理掩埋、酸堿中和等，不能從根本上對其進(jìn)行有效地控制治理。近年來越來越多的科學(xué)家認(rèn)為，可以通過研究參與酸性礦山環(huán)境形成的微生物入手，從源頭上遏制酸性礦山環(huán)境的形成。那么銅陵酸性礦山環(huán)境中有哪些微生物群落呢？興趣小組的學(xué)生利用高中生物選修一《生物技術(shù)實踐》中所學(xué)到的“微生物的分離與培養(yǎng)”的有關(guān)知識，設(shè)計實驗，分離培養(yǎng)出了銅陵酸性礦山環(huán)境中的微生物。

2 研究過程

2.1 采集樣品

從安徽省銅陵獅子山尾礦區(qū)的一處酸性礦山排水溪流（N30°54′18.8″，E117°53′58.0″）沿山自上到下選取3個采樣點，在每個采樣點采集100 mL AMD樣品，裝在經(jīng)高壓蒸汽滅菌的血清瓶中，分別標(biāo)記后快速放置到冰盒中。

在尾砂庫（N30°54′37.8″，E117°53′51.0″）采集具有典型特征的尾砂樣品2個，將尾砂樣品裝在滅菌的三角瓶中，用封口膜包扎，分別標(biāo)記后放置到冰盒中，快速帶回實驗室。

2.2 酸性礦山環(huán)境樣品的地化分析

將采集的樣品進(jìn)行地化指標(biāo)分析，金屬元素含量分析采用ICP-MS完成，上述地化指標(biāo)分析委托南京大學(xué)分析中心完成。

2.3 微生物分離純化培養(yǎng)基配制

根據(jù)酸性礦山環(huán)境的特點，微生物分離純化培養(yǎng)基選用FeO培養(yǎng)基[A液：稱取7.00 g FeSO4·7H2O溶解在25 mL H2O中，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，采用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用；B液：分別稱取1.80 g(NH4)2SO4，0.70 g MgSO4·7H2O，0.25 g TSB（蛋白胨大豆肉湯）溶解于725 mL H2O中，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.5；C液：取10 g瓊脂糖溶解在250 mL H2O中，B、C液采用高壓蒸汽濕熱滅菌，待冷卻至50℃時，將A、B、C三種液體混合均勻，然后倒半杯制作固體培養(yǎng)基]；同時采用改良牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，H2O 1 000 mL，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.5~3.0）對樣品中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析。

2.4 微生物的分離純化

將采集的樣品用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后涂布在FeO培養(yǎng)基、改良NA培養(yǎng)基上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。待菌落長出后，選取具有典型特征的單菌落，采用四區(qū)平板劃線法逐次進(jìn)行分離純化，直至得到純培養(yǎng)物。對純化得到的微生物的菌落和菌體進(jìn)行形態(tài)特征觀察，并進(jìn)行簡單染色、芽孢染色與革蘭氏染色鑒定。

2.5 酸性礦山環(huán)境樣品中分離純化微生物的種屬初步界定

將純化所得菌株在相應(yīng)分離液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心獲取菌體，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取相應(yīng)菌株的DNA。提取得到分離純化菌株的總基因組DNA后，利用通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTG GCTCAG；1541R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA）對菌株16 S rRNA基因進(jìn)行PCR擴增。DNA擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗純度及含量后進(jìn)行測序。

將測得的16 S rRNA基因序列提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，同時在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，初步鑒定其種屬關(guān)系，以確定酸性礦山環(huán)境微生物群落構(gòu)成。

3 研究結(jié)果

3.1 酸性礦山環(huán)境樣品的地化指標(biāo)

地化分析的結(jié)果見表1，表明，銅陵獅子山酸性礦山環(huán)境具有低pH、重金屬種類多、硫酸鹽含量高等特點，pH大約在2.5~4.0。重金屬種類主要包括Al、As、Ba、Cu、Fe、Hg等。AMD與尾砂中鐵的含量較高，該地區(qū)重金屬污染較為嚴(yán)重。

3.2 酸性礦山環(huán)境樣品分離的微生物形態(tài)特征

利用配制的FeO、改良NA培養(yǎng)基兩種選擇性培養(yǎng)基從酸礦水和尾砂樣品中分離純化得到FZ-1、FZ-2、FZ-3、FZ-5、FZ-6、FZ-7、FZ-8、FZ-9等共8株細(xì)菌（圖1），其篩選培養(yǎng)基、菌落形態(tài)、菌體形態(tài)特征如表2所示。

3.3 酸性礦山環(huán)境樣品中分離純化微生物的種屬初步界定

分別將純化得到的8株微生物的16 S rRNA序列在NCBI基因庫中進(jìn)行比對，結(jié)果表明FZ-1與Acidiphilium sp.YA-4(AM176778.1)的序列同源性達(dá)到99%，推測FZ-1可能是Acidiphilium屬的一類微生物；FZ-6與Acidisphaera rubrifaciens(D86512.1)的序列同源性達(dá)98%，推測FZ-6可能是Acidisphaera屬的一類微生物；FZ-3與Acidithiobacillus sp.YP-5(EU084708.1)的序列同源性均達(dá)99%，F(xiàn)Z-5與Acidithiobacillus ferrooxidans Strain BRGM1(AJ457806.1)的序列同源性達(dá)99%，推測FZ-3、FZ-5可能是Acidithiobacillus屬的一類微生物；FZ-2、FZ-9與Hydrotalea mesoacidophilus NJU-AMDS2親緣關(guān)系很近，其序列同源性達(dá)100%，推測FZ-2、FZ-9可能是Hydrotalea屬的一類微生物；FZ-7、FZ-8與Bacillus subtilis的序列同源性達(dá)99%，推測FZ-7、FZ-8可能是Bacillus屬的一類微生物。對以上得到的微生物種屬關(guān)系還需要結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征、化學(xué)分類以及DNA雜交等數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論與討論

利用FeO、改良NA培養(yǎng)基從銅陵獅子山尾礦區(qū)采集的AMD和尾砂樣品中分離純化得到8株微生物，通過對其形態(tài)特征觀察和16 S rRNA基因序列分析，得到的8株微生物可分為Acidiphilium、Acidisphaera、Acidithiobacillus、Hydrotalea、Bacillus等5個屬微生物；通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這8株微生物可能與酸性礦山環(huán)境的形成都有著一定的關(guān)系。

本生物興趣小組結(jié)合酸性礦山環(huán)境的污染問題，利用高中生物課本中所學(xué)的知識，就酸性礦山環(huán)境的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行了探究。圍繞著該研究課題，本小組在教師的幫助下，查閱文獻(xiàn)資料并根據(jù)學(xué)校實驗室的具體條件，確定了研究內(nèi)容和研究方案，并進(jìn)行了長達(dá)一年的研究，對酸性礦山環(huán)境中微生物的群落構(gòu)成有了初步了解，對酸性礦山環(huán)境的形成有了一定的認(rèn)識。

雖然現(xiàn)階段的研究結(jié)果還很簡單，但在整個研究性學(xué)習(xí)中，學(xué)生收獲了許多書本以外的知識，近距離地領(lǐng)略了科研探究活動，同時鍛煉了自己的團隊合作能力，也在一定程度上增強了自己的科學(xué)研究能力，為接下來微生物功能研究以及模擬酸性礦山環(huán)境的形成打下了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Colmer A R,Hinkle M E.1947.The role of microorganisms in acid mine drainage[J]. Science,106(3):253-256.

［2］ Coupland K, Johnson D B.Evidence that the potential for dissimilatory ferric iron reduction is widespread among acidophilic heterotrophic bacteria[J]. FEMS Microbiology Letters, 2008，279(1):30-35.

［3］ Johnson D B.Selective solid media for isolating and enumerating acidophilic bacteria [J]. Journal of Microbiological Methods,1995，23(2):205-218.

［4］ 汪忠.生物選修一·生物技術(shù)實踐[M].南京：江蘇教育出版社,2011.

endprint

摘 要 生物興趣小組對酸性礦山環(huán)境的微生物群落進(jìn)行了調(diào)查分析，利用FeO、改良NA培養(yǎng)基兩種選擇性培養(yǎng)基從銅陵獅子山尾礦區(qū)采集的酸性礦山廢水和尾砂樣品中分離純化得到8株微生物，通過對其形態(tài)特征觀察和16 S rRNA基因序列分析，得到的8株微生物可分為Acidiphilium、Acidisphaera等5個屬微生物。

關(guān)鍵詞 酸性礦山環(huán)境 微生物培養(yǎng) 調(diào)查

中圖分類號 Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B

1 課題提出

南京師范大學(xué)附屬中學(xué)生物興趣小組利用社會實踐的機會參觀了安徽銅陵獅子山酸性尾礦區(qū)。該尾礦區(qū)是由銅礦開采后丟棄的硫化物礦石等堆積形成的，這些硫化物廢礦石與大氣圈中的水、氧氣接觸后，在一系列的微生物作用下形成酸性礦山廢水（Acid Mine Drainage,AMD）與酸性尾砂，AMD與酸性尾砂構(gòu)成了酸性礦山環(huán)境。酸性礦山環(huán)境具有pH低、硫酸鹽含量高的特點，同時往往還含有大量重金屬離子。AMD一旦排入周圍環(huán)境中，會對河流、湖泊、土壤、地下水等造成嚴(yán)重污染，其中重金屬等有害物質(zhì)還能通過魚類、植物等從食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康。

酸性礦山環(huán)境形成后，周圍的生態(tài)環(huán)境往往需要上百年時間才能恢復(fù)，目前采用的治理方法主要是物理掩埋、酸堿中和等，不能從根本上對其進(jìn)行有效地控制治理。近年來越來越多的科學(xué)家認(rèn)為，可以通過研究參與酸性礦山環(huán)境形成的微生物入手，從源頭上遏制酸性礦山環(huán)境的形成。那么銅陵酸性礦山環(huán)境中有哪些微生物群落呢？興趣小組的學(xué)生利用高中生物選修一《生物技術(shù)實踐》中所學(xué)到的“微生物的分離與培養(yǎng)”的有關(guān)知識，設(shè)計實驗，分離培養(yǎng)出了銅陵酸性礦山環(huán)境中的微生物。

2 研究過程

2.1 采集樣品

從安徽省銅陵獅子山尾礦區(qū)的一處酸性礦山排水溪流（N30°54′18.8″，E117°53′58.0″）沿山自上到下選取3個采樣點，在每個采樣點采集100 mL AMD樣品，裝在經(jīng)高壓蒸汽滅菌的血清瓶中，分別標(biāo)記后快速放置到冰盒中。

在尾砂庫（N30°54′37.8″，E117°53′51.0″）采集具有典型特征的尾砂樣品2個，將尾砂樣品裝在滅菌的三角瓶中，用封口膜包扎，分別標(biāo)記后放置到冰盒中，快速帶回實驗室。

2.2 酸性礦山環(huán)境樣品的地化分析

將采集的樣品進(jìn)行地化指標(biāo)分析，金屬元素含量分析采用ICP-MS完成，上述地化指標(biāo)分析委托南京大學(xué)分析中心完成。

2.3 微生物分離純化培養(yǎng)基配制

根據(jù)酸性礦山環(huán)境的特點，微生物分離純化培養(yǎng)基選用FeO培養(yǎng)基[A液：稱取7.00 g FeSO4·7H2O溶解在25 mL H2O中，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，采用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用；B液：分別稱取1.80 g(NH4)2SO4，0.70 g MgSO4·7H2O，0.25 g TSB（蛋白胨大豆肉湯）溶解于725 mL H2O中，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.5；C液：取10 g瓊脂糖溶解在250 mL H2O中，B、C液采用高壓蒸汽濕熱滅菌，待冷卻至50℃時，將A、B、C三種液體混合均勻，然后倒半杯制作固體培養(yǎng)基]；同時采用改良牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，H2O 1 000 mL，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.5~3.0）對樣品中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析。

2.4 微生物的分離純化

將采集的樣品用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后涂布在FeO培養(yǎng)基、改良NA培養(yǎng)基上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。待菌落長出后，選取具有典型特征的單菌落，采用四區(qū)平板劃線法逐次進(jìn)行分離純化，直至得到純培養(yǎng)物。對純化得到的微生物的菌落和菌體進(jìn)行形態(tài)特征觀察，并進(jìn)行簡單染色、芽孢染色與革蘭氏染色鑒定。

2.5 酸性礦山環(huán)境樣品中分離純化微生物的種屬初步界定

將純化所得菌株在相應(yīng)分離液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心獲取菌體，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取相應(yīng)菌株的DNA。提取得到分離純化菌株的總基因組DNA后，利用通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTG GCTCAG；1541R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA）對菌株16 S rRNA基因進(jìn)行PCR擴增。DNA擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗純度及含量后進(jìn)行測序。

將測得的16 S rRNA基因序列提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，同時在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，初步鑒定其種屬關(guān)系，以確定酸性礦山環(huán)境微生物群落構(gòu)成。

3 研究結(jié)果

3.1 酸性礦山環(huán)境樣品的地化指標(biāo)

地化分析的結(jié)果見表1，表明，銅陵獅子山酸性礦山環(huán)境具有低pH、重金屬種類多、硫酸鹽含量高等特點，pH大約在2.5~4.0。重金屬種類主要包括Al、As、Ba、Cu、Fe、Hg等。AMD與尾砂中鐵的含量較高，該地區(qū)重金屬污染較為嚴(yán)重。

3.2 酸性礦山環(huán)境樣品分離的微生物形態(tài)特征

利用配制的FeO、改良NA培養(yǎng)基兩種選擇性培養(yǎng)基從酸礦水和尾砂樣品中分離純化得到FZ-1、FZ-2、FZ-3、FZ-5、FZ-6、FZ-7、FZ-8、FZ-9等共8株細(xì)菌（圖1），其篩選培養(yǎng)基、菌落形態(tài)、菌體形態(tài)特征如表2所示。

3.3 酸性礦山環(huán)境樣品中分離純化微生物的種屬初步界定

分別將純化得到的8株微生物的16 S rRNA序列在NCBI基因庫中進(jìn)行比對，結(jié)果表明FZ-1與Acidiphilium sp.YA-4(AM176778.1)的序列同源性達(dá)到99%，推測FZ-1可能是Acidiphilium屬的一類微生物；FZ-6與Acidisphaera rubrifaciens(D86512.1)的序列同源性達(dá)98%，推測FZ-6可能是Acidisphaera屬的一類微生物；FZ-3與Acidithiobacillus sp.YP-5(EU084708.1)的序列同源性均達(dá)99%，F(xiàn)Z-5與Acidithiobacillus ferrooxidans Strain BRGM1(AJ457806.1)的序列同源性達(dá)99%，推測FZ-3、FZ-5可能是Acidithiobacillus屬的一類微生物；FZ-2、FZ-9與Hydrotalea mesoacidophilus NJU-AMDS2親緣關(guān)系很近，其序列同源性達(dá)100%，推測FZ-2、FZ-9可能是Hydrotalea屬的一類微生物；FZ-7、FZ-8與Bacillus subtilis的序列同源性達(dá)99%，推測FZ-7、FZ-8可能是Bacillus屬的一類微生物。對以上得到的微生物種屬關(guān)系還需要結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征、化學(xué)分類以及DNA雜交等數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論與討論

利用FeO、改良NA培養(yǎng)基從銅陵獅子山尾礦區(qū)采集的AMD和尾砂樣品中分離純化得到8株微生物，通過對其形態(tài)特征觀察和16 S rRNA基因序列分析，得到的8株微生物可分為Acidiphilium、Acidisphaera、Acidithiobacillus、Hydrotalea、Bacillus等5個屬微生物；通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這8株微生物可能與酸性礦山環(huán)境的形成都有著一定的關(guān)系。

本生物興趣小組結(jié)合酸性礦山環(huán)境的污染問題，利用高中生物課本中所學(xué)的知識，就酸性礦山環(huán)境的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行了探究。圍繞著該研究課題，本小組在教師的幫助下，查閱文獻(xiàn)資料并根據(jù)學(xué)校實驗室的具體條件，確定了研究內(nèi)容和研究方案，并進(jìn)行了長達(dá)一年的研究，對酸性礦山環(huán)境中微生物的群落構(gòu)成有了初步了解，對酸性礦山環(huán)境的形成有了一定的認(rèn)識。

雖然現(xiàn)階段的研究結(jié)果還很簡單，但在整個研究性學(xué)習(xí)中，學(xué)生收獲了許多書本以外的知識，近距離地領(lǐng)略了科研探究活動，同時鍛煉了自己的團隊合作能力，也在一定程度上增強了自己的科學(xué)研究能力，為接下來微生物功能研究以及模擬酸性礦山環(huán)境的形成打下了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Colmer A R,Hinkle M E.1947.The role of microorganisms in acid mine drainage[J]. Science,106(3):253-256.

［2］ Coupland K, Johnson D B.Evidence that the potential for dissimilatory ferric iron reduction is widespread among acidophilic heterotrophic bacteria[J]. FEMS Microbiology Letters, 2008，279(1):30-35.

［3］ Johnson D B.Selective solid media for isolating and enumerating acidophilic bacteria [J]. Journal of Microbiological Methods,1995，23(2):205-218.

［4］ 汪忠.生物選修一·生物技術(shù)實踐[M].南京：江蘇教育出版社,2011.

endprint

摘 要 生物興趣小組對酸性礦山環(huán)境的微生物群落進(jìn)行了調(diào)查分析，利用FeO、改良NA培養(yǎng)基兩種選擇性培養(yǎng)基從銅陵獅子山尾礦區(qū)采集的酸性礦山廢水和尾砂樣品中分離純化得到8株微生物，通過對其形態(tài)特征觀察和16 S rRNA基因序列分析，得到的8株微生物可分為Acidiphilium、Acidisphaera等5個屬微生物。

關(guān)鍵詞 酸性礦山環(huán)境 微生物培養(yǎng) 調(diào)查

中圖分類號 Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B

1 課題提出

南京師范大學(xué)附屬中學(xué)生物興趣小組利用社會實踐的機會參觀了安徽銅陵獅子山酸性尾礦區(qū)。該尾礦區(qū)是由銅礦開采后丟棄的硫化物礦石等堆積形成的，這些硫化物廢礦石與大氣圈中的水、氧氣接觸后，在一系列的微生物作用下形成酸性礦山廢水（Acid Mine Drainage,AMD）與酸性尾砂，AMD與酸性尾砂構(gòu)成了酸性礦山環(huán)境。酸性礦山環(huán)境具有pH低、硫酸鹽含量高的特點，同時往往還含有大量重金屬離子。AMD一旦排入周圍環(huán)境中，會對河流、湖泊、土壤、地下水等造成嚴(yán)重污染，其中重金屬等有害物質(zhì)還能通過魚類、植物等從食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康。

酸性礦山環(huán)境形成后，周圍的生態(tài)環(huán)境往往需要上百年時間才能恢復(fù)，目前采用的治理方法主要是物理掩埋、酸堿中和等，不能從根本上對其進(jìn)行有效地控制治理。近年來越來越多的科學(xué)家認(rèn)為，可以通過研究參與酸性礦山環(huán)境形成的微生物入手，從源頭上遏制酸性礦山環(huán)境的形成。那么銅陵酸性礦山環(huán)境中有哪些微生物群落呢？興趣小組的學(xué)生利用高中生物選修一《生物技術(shù)實踐》中所學(xué)到的“微生物的分離與培養(yǎng)”的有關(guān)知識，設(shè)計實驗，分離培養(yǎng)出了銅陵酸性礦山環(huán)境中的微生物。

2 研究過程

2.1 采集樣品

從安徽省銅陵獅子山尾礦區(qū)的一處酸性礦山排水溪流（N30°54′18.8″，E117°53′58.0″）沿山自上到下選取3個采樣點，在每個采樣點采集100 mL AMD樣品，裝在經(jīng)高壓蒸汽滅菌的血清瓶中，分別標(biāo)記后快速放置到冰盒中。

在尾砂庫（N30°54′37.8″，E117°53′51.0″）采集具有典型特征的尾砂樣品2個，將尾砂樣品裝在滅菌的三角瓶中，用封口膜包扎，分別標(biāo)記后放置到冰盒中，快速帶回實驗室。

2.2 酸性礦山環(huán)境樣品的地化分析

將采集的樣品進(jìn)行地化指標(biāo)分析，金屬元素含量分析采用ICP-MS完成，上述地化指標(biāo)分析委托南京大學(xué)分析中心完成。

2.3 微生物分離純化培養(yǎng)基配制

根據(jù)酸性礦山環(huán)境的特點，微生物分離純化培養(yǎng)基選用FeO培養(yǎng)基[A液：稱取7.00 g FeSO4·7H2O溶解在25 mL H2O中，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，采用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用；B液：分別稱取1.80 g(NH4)2SO4，0.70 g MgSO4·7H2O，0.25 g TSB（蛋白胨大豆肉湯）溶解于725 mL H2O中，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.5；C液：取10 g瓊脂糖溶解在250 mL H2O中，B、C液采用高壓蒸汽濕熱滅菌，待冷卻至50℃時，將A、B、C三種液體混合均勻，然后倒半杯制作固體培養(yǎng)基]；同時采用改良牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，H2O 1 000 mL，利用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2.5~3.0）對樣品中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析。

2.4 微生物的分離純化

將采集的樣品用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后涂布在FeO培養(yǎng)基、改良NA培養(yǎng)基上，進(jìn)行分離培養(yǎng)。待菌落長出后，選取具有典型特征的單菌落，采用四區(qū)平板劃線法逐次進(jìn)行分離純化，直至得到純培養(yǎng)物。對純化得到的微生物的菌落和菌體進(jìn)行形態(tài)特征觀察，并進(jìn)行簡單染色、芽孢染色與革蘭氏染色鑒定。

2.5 酸性礦山環(huán)境樣品中分離純化微生物的種屬初步界定

將純化所得菌株在相應(yīng)分離液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，離心獲取菌體，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取相應(yīng)菌株的DNA。提取得到分離純化菌株的總基因組DNA后，利用通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTG GCTCAG；1541R：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA）對菌株16 S rRNA基因進(jìn)行PCR擴增。DNA擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗純度及含量后進(jìn)行測序。

將測得的16 S rRNA基因序列提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，同時在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，初步鑒定其種屬關(guān)系，以確定酸性礦山環(huán)境微生物群落構(gòu)成。

3 研究結(jié)果

3.1 酸性礦山環(huán)境樣品的地化指標(biāo)

地化分析的結(jié)果見表1，表明，銅陵獅子山酸性礦山環(huán)境具有低pH、重金屬種類多、硫酸鹽含量高等特點，pH大約在2.5~4.0。重金屬種類主要包括Al、As、Ba、Cu、Fe、Hg等。AMD與尾砂中鐵的含量較高，該地區(qū)重金屬污染較為嚴(yán)重。

3.2 酸性礦山環(huán)境樣品分離的微生物形態(tài)特征

利用配制的FeO、改良NA培養(yǎng)基兩種選擇性培養(yǎng)基從酸礦水和尾砂樣品中分離純化得到FZ-1、FZ-2、FZ-3、FZ-5、FZ-6、FZ-7、FZ-8、FZ-9等共8株細(xì)菌（圖1），其篩選培養(yǎng)基、菌落形態(tài)、菌體形態(tài)特征如表2所示。

3.3 酸性礦山環(huán)境樣品中分離純化微生物的種屬初步界定

分別將純化得到的8株微生物的16 S rRNA序列在NCBI基因庫中進(jìn)行比對，結(jié)果表明FZ-1與Acidiphilium sp.YA-4(AM176778.1)的序列同源性達(dá)到99%，推測FZ-1可能是Acidiphilium屬的一類微生物；FZ-6與Acidisphaera rubrifaciens(D86512.1)的序列同源性達(dá)98%，推測FZ-6可能是Acidisphaera屬的一類微生物；FZ-3與Acidithiobacillus sp.YP-5(EU084708.1)的序列同源性均達(dá)99%，F(xiàn)Z-5與Acidithiobacillus ferrooxidans Strain BRGM1(AJ457806.1)的序列同源性達(dá)99%，推測FZ-3、FZ-5可能是Acidithiobacillus屬的一類微生物；FZ-2、FZ-9與Hydrotalea mesoacidophilus NJU-AMDS2親緣關(guān)系很近，其序列同源性達(dá)100%，推測FZ-2、FZ-9可能是Hydrotalea屬的一類微生物；FZ-7、FZ-8與Bacillus subtilis的序列同源性達(dá)99%，推測FZ-7、FZ-8可能是Bacillus屬的一類微生物。對以上得到的微生物種屬關(guān)系還需要結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征、化學(xué)分類以及DNA雜交等數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論與討論

利用FeO、改良NA培養(yǎng)基從銅陵獅子山尾礦區(qū)采集的AMD和尾砂樣品中分離純化得到8株微生物，通過對其形態(tài)特征觀察和16 S rRNA基因序列分析，得到的8株微生物可分為Acidiphilium、Acidisphaera、Acidithiobacillus、Hydrotalea、Bacillus等5個屬微生物；通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這8株微生物可能與酸性礦山環(huán)境的形成都有著一定的關(guān)系。

本生物興趣小組結(jié)合酸性礦山環(huán)境的污染問題，利用高中生物課本中所學(xué)的知識，就酸性礦山環(huán)境的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行了探究。圍繞著該研究課題，本小組在教師的幫助下，查閱文獻(xiàn)資料并根據(jù)學(xué)校實驗室的具體條件，確定了研究內(nèi)容和研究方案，并進(jìn)行了長達(dá)一年的研究，對酸性礦山環(huán)境中微生物的群落構(gòu)成有了初步了解，對酸性礦山環(huán)境的形成有了一定的認(rèn)識。

雖然現(xiàn)階段的研究結(jié)果還很簡單，但在整個研究性學(xué)習(xí)中，學(xué)生收獲了許多書本以外的知識，近距離地領(lǐng)略了科研探究活動，同時鍛煉了自己的團隊合作能力，也在一定程度上增強了自己的科學(xué)研究能力，為接下來微生物功能研究以及模擬酸性礦山環(huán)境的形成打下了一定的基礎(chǔ)。

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