基于GSS序列的猴面花miRNA生物信息學(xué)研究

李崇奇+周鵬+蔡望偉

基金項(xiàng)目 海南省研究生創(chuàng)新科研課題（Hyb2012-2）；海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金（HY2013-18）。

摘要應(yīng)用miRtour在線分析工具對(duì)猴面花GSS序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)猴面花的miRNA序列，應(yīng)用psrobot預(yù)測(cè) miRNA的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50條不同的猴面花miRNA成熟序列，尿嘧啶在miRNA 5′端第1堿基出現(xiàn)頻率最高，有64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控。靶基因中有15個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，有21個(gè)編碼酶。

關(guān)鍵詞猴面花；miRNA；生物信息學(xué)；GSS序列

中圖分類(lèi)號(hào)Q74文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2014）11-0345-03

BioinformaticsStudyonmiRNAinMimulusgutatusBasedonGSSSequences

LI Chong-qi 1，2，3ZHOU Peng 2，3CAI Wang-wei 1 *

（1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，Hainan Medical College，Haikou Hainan 571199； 2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology/Analysis & Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences； 3 College of Agronomy，Hainan University）

AbstractMimulus gutatus miRNA was predicted based on GSS Sequences by miRtour，whereas miRNA-targeted mRNAs were predicted by psrobot. 50 unique mature miRNA sequences were found in which the uracil nucleotide is dominant in the first position of 5′mature miRNAs. 64 mRNAs were regulated by miRNA in which 15 targets was transcription factors，21 targets was enzymes.

Key wordsMimulus gutatus；miRNA；bioinformatics；GSS sequence

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為19~24 bp的內(nèi)源性小RNA分子，其主要通過(guò)與靶基因結(jié)合后在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。由中介子（Mediator）將RNA聚合酶Ⅱ招募到miRNA基因的啟動(dòng)子后轉(zhuǎn)錄miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary miRNA，pri-miRNA）[1]，然后經(jīng)歷與mRNA相同的加帽、加尾和拼接過(guò)程后，形成獨(dú)特的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[2]，植物中再在DCL蛋白的作用下加工為miRNA前體序列（precursor-miRNA，pre-miRNA）。miRNA前體序列再經(jīng)過(guò)一些列復(fù)雜過(guò)程加工為成熟的miRNA序列后，與Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合體后與靶基因結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。由于miRNA參與了植物器官的發(fā)育、代謝的調(diào)節(jié)和抗逆反應(yīng)等一系列復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程[3]，因而近年來(lái)miRNA被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳品質(zhì)改良工作。

而猴面花（Mimulus gutatus）為玄參科溝酸漿屬草本植物，原產(chǎn)于北美西部，現(xiàn)在世界范圍內(nèi)被廣泛栽培。猴面花可用于公園、小區(qū)的花壇、花臺(tái)、花境栽培觀賞，也是庭院及居室栽培的優(yōu)良材料[4]。此外猴面花還是被廣泛應(yīng)用于生態(tài)和進(jìn)化遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的模式生物[5]。本研究擬應(yīng)用miRtour在線分析工具（http：//bio2server.bioinfo. uni-plovdiv.bg/miRTour/）[6]對(duì)猴面花的GSS序列進(jìn)行分析，識(shí)別其miRNA基因和靶基因，為進(jìn)一步開(kāi)展猴面花遺傳品質(zhì)改良工作和探討猴面花獨(dú)特的生態(tài)特點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biote-chnology Information，NCBI）的網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）的GSS數(shù)據(jù)庫(kù)中下載134 919條猴面花序列，另外分別從rfam網(wǎng)站（http：//rfam.sanger.ac.uk/）和pfam網(wǎng)站（http：//pfam.sanger.ac.uk/）下載非編碼RNA數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2研究方法

將猴面花GSS序列分批遞交到miRtour網(wǎng)站上傳后參數(shù)設(shè)置如下：與已知miRNA序列能夠比對(duì)的最小數(shù)量（Minimum number of known miRNAs to be aligned）設(shè)置為1，miRNA序列與其互補(bǔ)序列的不配對(duì)數(shù)（Maximum unpaired nt in miR/miR*）設(shè)置為6，其他參數(shù)默認(rèn)。下載分析結(jié)果可以得到相應(yīng)的miRNA序列、前體序列以及前體序列的最小自由能、最小自由能指數(shù)等相關(guān)參數(shù)。然后應(yīng)用Blast-2.2.27+軟件中的blastn程序?qū)㈩A(yù)測(cè)到的miRNA前體序列與rfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用blastx程序與pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將evalue參數(shù)設(shè)置為1e-6，去除非miRNA序列，即可得到miRNA前體序列和相應(yīng)的miRNA序列。將預(yù)測(cè)到的成熟猴面花miRNA序列以fasta格式上傳到psrobot網(wǎng)站（http：//omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/index.php）[7]進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，參數(shù)選擇嚴(yán)格模式，同時(shí)將分值（score）設(shè)置為2.5。應(yīng)用bioedit統(tǒng)計(jì)miRNA及其前體的序列長(zhǎng)度，然后統(tǒng)計(jì)miRNA序列每個(gè)位點(diǎn)的堿基組成，對(duì)其堿基偏倚進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1miRNA預(yù)測(cè)

134 919條猴面花GSS序列經(jīng)過(guò)miRtour分析后共發(fā)現(xiàn)72條具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，與rfam和pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)2條蛋白質(zhì)序列，去除重復(fù)預(yù)測(cè)miRNA序列后，共預(yù)測(cè)到50條不同的猴面花miRNA成熟序列（表1）。這50條猴面花miRNA序列隸屬于35個(gè)不同的miRNA家族，其中成員最多的為miR2607家族，有6個(gè)成員。所有前體序列的最小自由能都為負(fù)值，最高的為mgu-miR1534，其自由能為-32.64 kJ/mol。前體序列的最小自由能指數(shù)為0.70～1.13，GC含量為12.22%～72.51%。

2.2miRNA和前體的堿基組成特征

猴面花miRNA長(zhǎng)度為18～23 nt，其中35個(gè)miRNA長(zhǎng)度為21 nt。miRNA序列中嘌呤與嘧啶的比值為1.00∶0.97，其詳細(xì)堿基組成A∶G∶C∶U為1.00∶0.89∶0.67∶1.17，胞嘧啶比例明顯偏低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在miRNA 5′端第1~2堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率都最高，分別為42%和60%。而腺嘌呤則在第15堿基、鳥(niǎo)嘌呤在第12和第14堿基、胞嘧啶在第4和第20堿基出現(xiàn)頻率最高。miRNA前體長(zhǎng)度為90～223 nt，平均長(zhǎng)度為179 nt，嘌呤與嘧啶的比值為1.00∶0.99，堿基組成A∶G∶C∶U為1.00∶0.66∶0.51∶1.13，鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶比例偏低。

2.3miRNA靶基因預(yù)測(cè)

50個(gè)猴面花 miRNA中有25個(gè)預(yù)測(cè)到了靶基因，靶基因數(shù)目最多的為mgu-miR156，發(fā)現(xiàn)有10條編碼序列受其調(diào)控（表2）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)共64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控，大部分基因都受單一miRNA的調(diào)控。但發(fā)現(xiàn)編碼胡蘿卜素順?lè)串悩?gòu)酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b調(diào)控；編碼PHO2蛋白的mgv1a001292m同時(shí)受mgu-miR399a和mgu-miR399b調(diào)控，而且發(fā)現(xiàn)mgu-miR399b與mgv1a001292m有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分別為637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要有SPL轉(zhuǎn)錄因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA結(jié)合蛋白和鋅指蛋白等；此外還有21條靶基因序列編碼酶。

3結(jié)論與討論

GSS序列，又稱基因組勘測(cè)序列是基因組DNA克隆的一次性部分測(cè)序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測(cè)序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過(guò)Exon trapped獲得的基因組序列、通過(guò)Alu PCR 獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[8]，也被廣泛地應(yīng)用于植物miRNA的預(yù)測(cè)分析。應(yīng)用GSS序列識(shí)別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關(guān)，Zhang等[9]在棉花中發(fā)現(xiàn)30條miRNA序列，Xie等[10]在歐洲油菜（Brassica napus）8條miRNA序列，羅曉燕等[8]在核果類(lèi)作物中發(fā)現(xiàn)9條miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中發(fā)現(xiàn)17條，而李婧等[12]在玉米中僅發(fā)現(xiàn)3條。但Wang等[13]對(duì)甘藍(lán)（Brassica oleracea）的680 894條GSS序列研究中發(fā)現(xiàn)152個(gè)miRNA。而本研究中對(duì)猴面花134 919條GSS序列研究中共發(fā)現(xiàn)50個(gè)miRNA，其識(shí)別效率與其他基于GSS的研究相差不大。同時(shí)在本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 5′端第1堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率明顯高于其他堿基，這與在擬南芥和水稻的研究一致[14]，目前認(rèn)為miRNA5′端堿基對(duì)于其與選擇不同Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物是至關(guān)重要的[15]。然而整體來(lái)講，本研究中識(shí)別的猴面花miRNA數(shù)量與其真實(shí)的miRNA基因數(shù)量還有很大的差距，Bartel等[16]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，而事實(shí)上mirbase數(shù)據(jù)庫(kù)中有些植物的miRNA數(shù)量已經(jīng)達(dá)到700余條。因而猴面花的miRNA研究在未來(lái)還有待于基于全基因組范圍內(nèi)的生物信息學(xué)分析或通過(guò)小RNA測(cè)序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識(shí)別。

猴面花在北美西海岸地區(qū)為夏末季節(jié)開(kāi)花的多年生植物，而距據(jù)此不遠(yuǎn)的內(nèi)陸地區(qū)卻為春季開(kāi)花的一年生植物，研究表明這主要是由于猴面花對(duì)干旱的內(nèi)陸地區(qū)和潮濕高鹽的沿海地區(qū)適應(yīng)的結(jié)果[17]。Jorgensen等[18]認(rèn)為SPL轉(zhuǎn)錄因子家族可能通過(guò)調(diào)控開(kāi)花時(shí)間基因的表達(dá)決定物種是多年生植物還是一年生植物，同時(shí)近來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA156家族通過(guò)調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族決定植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA156的靶基因?yàn)镾PL轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)mgu-miR1862的靶基因?yàn)槿~綠體干旱誘導(dǎo)蛋白，但這2個(gè)miRNA是否與決定猴面花為多年生植物還是一年生植物直接相關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] KIM Y J，ZHENG B，YU Y，et al.The role of Mediator in small and long noncoding RNA production in Arabidopsis thaliana[J].The EMBO Journal，2011，30（5）：814-822.

[2] WU G.Plant microRNAs and development[J].Journal of Genetics and Genomics，2013，40（5）：217-230.

[3] YANG T W，XUE L G，AN L Z.Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4] 徐曄春.花色絢麗的猴面花[J].花木盆景：花卉園藝，2008（8）：2-3.

[5] WU C A，LOWRY D B，COOLEY A M，et al.Mimulus is an emerging model system for the integration of ecological and genomic studies[J].Heredity，2008，100（2）：220-230.

[6] MILEV I，YAHUBYAN G，MINKOV I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[7] WU H J，MA Y K，CHEN T，et al.PsRobot：a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox[J].Nucleic Acids Research，2012（W1）：22-28.

[8] 羅曉燕，侍婷，蔡斌，等.核果類(lèi)果樹(shù)中microRNAs的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（2）：75-81.

[9] ZHANG B，WANG Q，WANG K，et al.Identification of cotton microRNAs and their targets[J].Gene，2007，397（1-2）：26-37.

[10] XIE F L，HUANG S Q，GUO K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus[J].FEBS Lett，2007，581（7）：1464-1474.

[11] 杜江峰，武永軍，方曉峰，等.生物信息方法預(yù)測(cè)高粱miRNA及其靶基因[J].中國(guó)科學(xué)，2010，55（7）：553-561.

[12] 李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下轉(zhuǎn)第351頁(yè)）

（上接第347頁(yè)）

的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（12）：108-112.

[13] WANG J，YANG X，XU H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea[J].Gene，2012，505（2）：300-308.

[14] ZHANG B，PAN X，CANNON C，et al.Conservation and divergence of plant microRNA genes[J].Plant J，2006，46（2）：243-259.

[15] THIEME C J，SCHUDOMA C，MAY P，et al.Give It AGO：The Search for miRNA-Argonaute Sorting Signals in Arabidopsis thaliana Indicates a Relevance of Sequence Positions Other than the 5′-Position Alone[J].Front Plant Sci，2012（3）：272.

[16] BARTEL D P.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and fun-ction[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[17] LOWRY D B，ROCKWOOD R C，WILLIS J H.Ecological reproductive isolation of coast and inland races of Mimulus guttatus[J].Evolution，2008，62（9）：2196-2214.

[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.

2.3miRNA靶基因預(yù)測(cè)

50個(gè)猴面花 miRNA中有25個(gè)預(yù)測(cè)到了靶基因，靶基因數(shù)目最多的為mgu-miR156，發(fā)現(xiàn)有10條編碼序列受其調(diào)控（表2）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)共64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控，大部分基因都受單一miRNA的調(diào)控。但發(fā)現(xiàn)編碼胡蘿卜素順?lè)串悩?gòu)酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b調(diào)控；編碼PHO2蛋白的mgv1a001292m同時(shí)受mgu-miR399a和mgu-miR399b調(diào)控，而且發(fā)現(xiàn)mgu-miR399b與mgv1a001292m有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分別為637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要有SPL轉(zhuǎn)錄因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA結(jié)合蛋白和鋅指蛋白等；此外還有21條靶基因序列編碼酶。

3結(jié)論與討論

GSS序列，又稱基因組勘測(cè)序列是基因組DNA克隆的一次性部分測(cè)序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測(cè)序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過(guò)Exon trapped獲得的基因組序列、通過(guò)Alu PCR 獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[8]，也被廣泛地應(yīng)用于植物miRNA的預(yù)測(cè)分析。應(yīng)用GSS序列識(shí)別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關(guān)，Zhang等[9]在棉花中發(fā)現(xiàn)30條miRNA序列，Xie等[10]在歐洲油菜（Brassica napus）8條miRNA序列，羅曉燕等[8]在核果類(lèi)作物中發(fā)現(xiàn)9條miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中發(fā)現(xiàn)17條，而李婧等[12]在玉米中僅發(fā)現(xiàn)3條。但Wang等[13]對(duì)甘藍(lán)（Brassica oleracea）的680 894條GSS序列研究中發(fā)現(xiàn)152個(gè)miRNA。而本研究中對(duì)猴面花134 919條GSS序列研究中共發(fā)現(xiàn)50個(gè)miRNA，其識(shí)別效率與其他基于GSS的研究相差不大。同時(shí)在本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 5′端第1堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率明顯高于其他堿基，這與在擬南芥和水稻的研究一致[14]，目前認(rèn)為miRNA5′端堿基對(duì)于其與選擇不同Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物是至關(guān)重要的[15]。然而整體來(lái)講，本研究中識(shí)別的猴面花miRNA數(shù)量與其真實(shí)的miRNA基因數(shù)量還有很大的差距，Bartel等[16]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，而事實(shí)上mirbase數(shù)據(jù)庫(kù)中有些植物的miRNA數(shù)量已經(jīng)達(dá)到700余條。因而猴面花的miRNA研究在未來(lái)還有待于基于全基因組范圍內(nèi)的生物信息學(xué)分析或通過(guò)小RNA測(cè)序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識(shí)別。

猴面花在北美西海岸地區(qū)為夏末季節(jié)開(kāi)花的多年生植物，而距據(jù)此不遠(yuǎn)的內(nèi)陸地區(qū)卻為春季開(kāi)花的一年生植物，研究表明這主要是由于猴面花對(duì)干旱的內(nèi)陸地區(qū)和潮濕高鹽的沿海地區(qū)適應(yīng)的結(jié)果[17]。Jorgensen等[18]認(rèn)為SPL轉(zhuǎn)錄因子家族可能通過(guò)調(diào)控開(kāi)花時(shí)間基因的表達(dá)決定物種是多年生植物還是一年生植物，同時(shí)近來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA156家族通過(guò)調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族決定植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA156的靶基因?yàn)镾PL轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)mgu-miR1862的靶基因?yàn)槿~綠體干旱誘導(dǎo)蛋白，但這2個(gè)miRNA是否與決定猴面花為多年生植物還是一年生植物直接相關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] KIM Y J，ZHENG B，YU Y，et al.The role of Mediator in small and long noncoding RNA production in Arabidopsis thaliana[J].The EMBO Journal，2011，30（5）：814-822.

[2] WU G.Plant microRNAs and development[J].Journal of Genetics and Genomics，2013，40（5）：217-230.

[3] YANG T W，XUE L G，AN L Z.Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4] 徐曄春.花色絢麗的猴面花[J].花木盆景：花卉園藝，2008（8）：2-3.

[5] WU C A，LOWRY D B，COOLEY A M，et al.Mimulus is an emerging model system for the integration of ecological and genomic studies[J].Heredity，2008，100（2）：220-230.

[6] MILEV I，YAHUBYAN G，MINKOV I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[7] WU H J，MA Y K，CHEN T，et al.PsRobot：a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox[J].Nucleic Acids Research，2012（W1）：22-28.

[8] 羅曉燕，侍婷，蔡斌，等.核果類(lèi)果樹(shù)中microRNAs的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（2）：75-81.

[9] ZHANG B，WANG Q，WANG K，et al.Identification of cotton microRNAs and their targets[J].Gene，2007，397（1-2）：26-37.

[10] XIE F L，HUANG S Q，GUO K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus[J].FEBS Lett，2007，581（7）：1464-1474.

[11] 杜江峰，武永軍，方曉峰，等.生物信息方法預(yù)測(cè)高粱miRNA及其靶基因[J].中國(guó)科學(xué)，2010，55（7）：553-561.

[12] 李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下轉(zhuǎn)第351頁(yè)）

（上接第347頁(yè)）

的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（12）：108-112.

[13] WANG J，YANG X，XU H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea[J].Gene，2012，505（2）：300-308.

[14] ZHANG B，PAN X，CANNON C，et al.Conservation and divergence of plant microRNA genes[J].Plant J，2006，46（2）：243-259.

[15] THIEME C J，SCHUDOMA C，MAY P，et al.Give It AGO：The Search for miRNA-Argonaute Sorting Signals in Arabidopsis thaliana Indicates a Relevance of Sequence Positions Other than the 5′-Position Alone[J].Front Plant Sci，2012（3）：272.

[16] BARTEL D P.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and fun-ction[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[17] LOWRY D B，ROCKWOOD R C，WILLIS J H.Ecological reproductive isolation of coast and inland races of Mimulus guttatus[J].Evolution，2008，62（9）：2196-2214.

[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.

2.3miRNA靶基因預(yù)測(cè)

50個(gè)猴面花 miRNA中有25個(gè)預(yù)測(cè)到了靶基因，靶基因數(shù)目最多的為mgu-miR156，發(fā)現(xiàn)有10條編碼序列受其調(diào)控（表2）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)共64條編碼序列受到猴面花miRNA的調(diào)控，大部分基因都受單一miRNA的調(diào)控。但發(fā)現(xiàn)編碼胡蘿卜素順?lè)串悩?gòu)酶的mgv1a008474m 序列受mgu-miR2607a和mgu-miR2607b調(diào)控；編碼PHO2蛋白的mgv1a001292m同時(shí)受mgu-miR399a和mgu-miR399b調(diào)控，而且發(fā)現(xiàn)mgu-miR399b與mgv1a001292m有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分別為637～657、700～720、757～777 nt。靶基因中有15個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，主要有SPL轉(zhuǎn)錄因子、AP2蛋白、核因子、bHLH DNA結(jié)合蛋白和鋅指蛋白等；此外還有21條靶基因序列編碼酶。

3結(jié)論與討論

GSS序列，又稱基因組勘測(cè)序列是基因組DNA克隆的一次性部分測(cè)序序列，包括隨機(jī)的基因組勘測(cè)序列、cosmid/BAC/YAC末端序列、通過(guò)Exon trapped獲得的基因組序列、通過(guò)Alu PCR 獲得的序列以及轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposon-tagged）序列等[8]，也被廣泛地應(yīng)用于植物miRNA的預(yù)測(cè)分析。應(yīng)用GSS序列識(shí)別植物miRNA的數(shù)量與其GSS序列數(shù)量密切相關(guān)，Zhang等[9]在棉花中發(fā)現(xiàn)30條miRNA序列，Xie等[10]在歐洲油菜（Brassica napus）8條miRNA序列，羅曉燕等[8]在核果類(lèi)作物中發(fā)現(xiàn)9條miRNA序列，杜江峰等[11]在高粱中發(fā)現(xiàn)17條，而李婧等[12]在玉米中僅發(fā)現(xiàn)3條。但Wang等[13]對(duì)甘藍(lán)（Brassica oleracea）的680 894條GSS序列研究中發(fā)現(xiàn)152個(gè)miRNA。而本研究中對(duì)猴面花134 919條GSS序列研究中共發(fā)現(xiàn)50個(gè)miRNA，其識(shí)別效率與其他基于GSS的研究相差不大。同時(shí)在本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 5′端第1堿基尿嘧啶的出現(xiàn)頻率明顯高于其他堿基，這與在擬南芥和水稻的研究一致[14]，目前認(rèn)為miRNA5′端堿基對(duì)于其與選擇不同Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物是至關(guān)重要的[15]。然而整體來(lái)講，本研究中識(shí)別的猴面花miRNA數(shù)量與其真實(shí)的miRNA基因數(shù)量還有很大的差距，Bartel等[16]認(rèn)為每個(gè)物種的miRNA數(shù)量應(yīng)該達(dá)到其基因數(shù)量的1%，而事實(shí)上mirbase數(shù)據(jù)庫(kù)中有些植物的miRNA數(shù)量已經(jīng)達(dá)到700余條。因而猴面花的miRNA研究在未來(lái)還有待于基于全基因組范圍內(nèi)的生物信息學(xué)分析或通過(guò)小RNA測(cè)序等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行識(shí)別。

猴面花在北美西海岸地區(qū)為夏末季節(jié)開(kāi)花的多年生植物，而距據(jù)此不遠(yuǎn)的內(nèi)陸地區(qū)卻為春季開(kāi)花的一年生植物，研究表明這主要是由于猴面花對(duì)干旱的內(nèi)陸地區(qū)和潮濕高鹽的沿海地區(qū)適應(yīng)的結(jié)果[17]。Jorgensen等[18]認(rèn)為SPL轉(zhuǎn)錄因子家族可能通過(guò)調(diào)控開(kāi)花時(shí)間基因的表達(dá)決定物種是多年生植物還是一年生植物，同時(shí)近來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA156家族通過(guò)調(diào)控SPL轉(zhuǎn)錄因子家族決定植物發(fā)育時(shí)相的轉(zhuǎn)變。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)miRNA156的靶基因?yàn)镾PL轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)mgu-miR1862的靶基因?yàn)槿~綠體干旱誘導(dǎo)蛋白，但這2個(gè)miRNA是否與決定猴面花為多年生植物還是一年生植物直接相關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] KIM Y J，ZHENG B，YU Y，et al.The role of Mediator in small and long noncoding RNA production in Arabidopsis thaliana[J].The EMBO Journal，2011，30（5）：814-822.

[2] WU G.Plant microRNAs and development[J].Journal of Genetics and Genomics，2013，40（5）：217-230.

[3] YANG T W，XUE L G，AN L Z.Functional diversity of miRNA in plants[J].Plant Science，2007，172（3）：423-432.

[4] 徐曄春.花色絢麗的猴面花[J].花木盆景：花卉園藝，2008（8）：2-3.

[5] WU C A，LOWRY D B，COOLEY A M，et al.Mimulus is an emerging model system for the integration of ecological and genomic studies[J].Heredity，2008，100（2）：220-230.

[6] MILEV I，YAHUBYAN G，MINKOV I，et al.miRTour：Plant miRNA and target prediction tool[J].Bioinformation，2011，6（6）：248-249.

[7] WU H J，MA Y K，CHEN T，et al.PsRobot：a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox[J].Nucleic Acids Research，2012（W1）：22-28.

[8] 羅曉燕，侍婷，蔡斌，等.核果類(lèi)果樹(shù)中microRNAs的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證[J].林業(yè)科學(xué)，2012，48（2）：75-81.

[9] ZHANG B，WANG Q，WANG K，et al.Identification of cotton microRNAs and their targets[J].Gene，2007，397（1-2）：26-37.

[10] XIE F L，HUANG S Q，GUO K，et al.Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus[J].FEBS Lett，2007，581（7）：1464-1474.

[11] 杜江峰，武永軍，方曉峰，等.生物信息方法預(yù)測(cè)高粱miRNA及其靶基因[J].中國(guó)科學(xué)，2010，55（7）：553-561.

[12] 李婧，熊莉麗，胡久梅，等.基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA（下轉(zhuǎn)第351頁(yè)）

（上接第347頁(yè)）

的數(shù)據(jù)挖掘[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（12）：108-112.

[13] WANG J，YANG X，XU H，et al.Identification and characterization of microRNAs and their target genes in Brassica oleracea[J].Gene，2012，505（2）：300-308.

[14] ZHANG B，PAN X，CANNON C，et al.Conservation and divergence of plant microRNA genes[J].Plant J，2006，46（2）：243-259.

[15] THIEME C J，SCHUDOMA C，MAY P，et al.Give It AGO：The Search for miRNA-Argonaute Sorting Signals in Arabidopsis thaliana Indicates a Relevance of Sequence Positions Other than the 5′-Position Alone[J].Front Plant Sci，2012（3）：272.

[16] BARTEL D P.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and fun-ction[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[17] LOWRY D B，ROCKWOOD R C，WILLIS J H.Ecological reproductive isolation of coast and inland races of Mimulus guttatus[J].Evolution，2008，62（9）：2196-2214.

[18] JORGENSEN S A，PRESTON J C.Differential SPL gene expression patterns reveal candidate genes underlying flowering time and architec-tural differences in Mimulus and Arabidopsis[J].Mol Phylogenet Evol，2014（73）：129-139.