南酸棗內(nèi)生細菌WYG5的鑒定及對芒果的防病效果

吳家飛+李曉宇+范詠梅+柳志強

摘要：從南酸棗（Choerospondias axillaris）中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，皿內(nèi)拮抗活性達32%，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），經(jīng)測定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對采后芒果均有顯著的保鮮防病效果，處理9 d后的防效分別為60.76%和59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%。

關(guān)鍵詞：南酸棗；內(nèi)生細菌；芒果炭疽病菌；防治效果

中圖分類號：Q939.95文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2398-03

Identification of Choerospondias axillaris Endophytic Bacterial Strain WYG5 and Its Effects on Preservating Postharvest Mango

WU Jia-fei，LI Xiao-yu，F(xiàn)AN Yong-mei，LIU Zhi-qiang

（College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Abstract：Strain WYG4，isolated from Choerospondias axi11aris（Roxb1） Burttet Hill，had higher antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides， with antagonistic activity of 32% in plate. According to its morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the strain WYG5 was identified as Bacillus megaterium. Its fermentation broth and fermentation filtrate had obvious effects on preservating postharvest mango. After 9 d and 12 d treatment，the controlling effects were up to 60.76%， 59.50% and 43.59%，34.19%， respectively.

Key words：Choerospondias axillaris； endophytic bacteria； Colletotrichum gloeosporioides； control effect

基金項目：國家自然科學基金項目（31160377）；國家科技支撐計劃項目（2012BAK01B05）

南酸棗（Choerospondias axillaris）為漆樹科南酸棗屬落葉大喬木，多年生，又名五眼果、酸棗樹、山棗子等，主要分布于云南、廣東、廣西、湖南、湖北、江西、福建、浙江、貴州等地區(qū)[1]，其樹皮和果實可以入藥，樹皮主治瘡瘍、湯火傷、陰囊濕疹；鮮果則消食滯，治食滯腹痛；果核醒酒解毒，治風毒起疙瘩成瘡或瘍癰[2]。

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段生活在活體植物組織內(nèi)，而不引起植物明顯病害的微生物[3]。許多研究表明植物中的內(nèi)生細菌對宿主具有抗病促生的能力，作為生物菌劑在生物防治方面和促進植物生長方面有著重要的應用價值[4，5]。試驗從南酸棗體內(nèi)分離出一株內(nèi)生細菌WYG5，發(fā)現(xiàn)其對芒果炭疽病菌具有較好的拮抗效果，利用常規(guī)方法結(jié)合16S rDNA序列分析對該菌株進行了鑒定，并測定了其對采后芒果的保鮮防病效果，為其今后應用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料南酸棗采自海南大學儋州校區(qū)，內(nèi)生細菌WYG5從南酸棗中經(jīng)組織表面消毒分離獲得。芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）由海南大學環(huán)境與植物保護學院提供，芒果品種為臺農(nóng)l號。

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，去離子水1 L。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)菌株WYG5經(jīng)活化后接入LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d，收集發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，將上清液利用0.22 μm的濾膜除菌過濾，得到發(fā)酵濾液。

1.2.2 菌株WYG5的鑒定采用常規(guī)鑒定方法進行[6]。菌株基因組DNA利用Bacterial DNA Kit（50）試劑盒提取，利用16S rDNA通用引物（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行基因擴增，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定，將所測序列在GenBank中進行Blast分析，根據(jù)Blast結(jié)果利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性測定 在直徑9 cm的PDA平板中央接種1塊直徑為5 mm芒果炭疽病菌的菌餅，菌絲面朝下，同時在菌餅兩側(cè)2 cm處各接入一環(huán)內(nèi)生細菌WYG5，以不接內(nèi)生細菌為對照，每處理3次重復，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，十字交叉法計算皿內(nèi)拮抗活性。

1.2.4菌株WYG5對芒果的防病效果取健康無病、大小均一、約八成熟芒果果實，用75%酒精表面消毒后，自然晾干備用。處理液包括發(fā)酵液、10倍稀釋發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、10倍稀釋發(fā)酵濾液，以去離子水處理為對照。處理時將果實分別于各處理液中浸泡10 min，晾干后裝入保鮮盒中放置，在處理后第6、9、12 天共調(diào)查3次，逐次記錄并累加炭疽病病果數(shù)和病級，計算病指和防效，并對防效進行方差分析。具體方法參照國家標準GB/T 17980.98-2004進行。

果實發(fā)病程度分級方法如下，0 級：無?。? 級：病斑面積占果實面積的5%以下；3 級：病斑面積占果實面積的 6%～15%；5 級：病斑面積占果實面積的 16%～25%；7 級：病斑面積占果實面積的 26%～50%；9 級：病斑面積占果實面積的 50%以上。試驗數(shù)據(jù)采用DPS處理，進行差異顯著性分析。

病情指數(shù)= [∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)）/（調(diào)查總果數(shù)×9）]×100

防效=[（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株WYG5的鑒定

菌株WYG5在培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淺黃色，邊緣整齊，表面有凸狀隆起，干燥，不透明，革蘭氏染色陽性，芽孢染色陽性，菌體桿狀，周生鞭毛。菌株WYG5 的形態(tài)和生理生化特征與東秀珠等[6]描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）特征相同。對菌株WYG5的16S rDNA序列進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到 1 515 bp的堿基序列。將16S rDNA 序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它與多株巨大芽孢桿菌菌株的同源性均在99%以上。選取GenBank中的8株芽孢桿菌屬的細菌與菌株WYG5一起，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建出基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可以看出，菌株WYG5與巨大芽孢桿菌的同源性最高，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特征分析，確定菌株WYG5為巨大芽孢桿菌。

2.2菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性的測定

采用十字交叉法測定菌株WYG5對芒果炭疽病菌的皿內(nèi)拮抗活性，結(jié)果表明，該內(nèi)生細菌對芒果炭疽病菌有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中的擴展，抑制率達到32%。

2.3菌株WYG5對芒果的防病效果

內(nèi)生細菌WYG5的不同處理液對采后芒果的保鮮防病效果見表1。6 d相對于芒果保鮮來說時間較短，6 d時對照組病情指數(shù)僅為7.04，處理防效雖高但意義不大，故重點討論了9 d和12 d的防效。其中菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理9 d時的防效分別為60.76%和59.50%，不存在顯著差異；12 d時的防效分別為43.59%和34.19%，存在極顯著差異，發(fā)酵液的保鮮防病效果明顯優(yōu)于發(fā)酵濾液。稀釋10倍發(fā)酵液處理9 d時的防效為54.43%，與發(fā)酵液處理不存在顯著差異，而處理12 d時兩處理防效差異極顯著。稀釋10倍發(fā)酵濾液處理9 d和12 d時的防效均極顯著低于發(fā)酵濾液的防效。

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌作為植物內(nèi)生細菌已有報道，如農(nóng)倩等[7]從水稻體內(nèi)分離到一株巨大芽孢桿菌B196，對水稻紋枯病菌的生長具有較強的抑制作用，盆栽和田間防效分別為64.29%和55.13%；林天興等[8]從苦豆子中分離出48株對棉花枯萎病菌和黃萎病菌有較強拮抗作用的內(nèi)生細菌，并對其遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；張鑫等[9]從無紋紫背苔葉片中分離出一株內(nèi)生菌z12，鑒定為巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻紋枯病菌均有較強的抑制作用；林娜等[10]從山蒼子的根、莖、葉和果中分離出內(nèi)生細菌52株，其中一株對辣椒疫霉病的防治效果較好，且可促進辣椒植株生長。試驗從南酸棗中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析，鑒定將該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)測定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對采后芒果均有明顯的保鮮防病效果，處理9 d后防效分別為 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%，有關(guān)該菌的抗病機理及抑菌活性物質(zhì)還有待進一步研究。

參考文獻：

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[3] 姜怡，楊穎，陳華紅，等.植物內(nèi)生菌資源[J].微生物學通報，2005，32（6）：146-147.

[4] 盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君.植物內(nèi)生細菌的分離、分類、定殖與應用[J].生命科學，2006，18（1）： 90-94.

[5] 張穎，王剛，郭建偉，等.利用小麥內(nèi)生細菌防治小麥全蝕病的初步研究[J].植物病理學報，2007，37（1）： 105-108.

[6] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京： 科學出版社，2001.

[7] 農(nóng)倩，陳雪鳳，黎起秦，等.水稻內(nèi)生細菌B196的鑒定及其對水稻紋枯病的防治作用[J].中國生物防治學報，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天興，李超，龔明福.拮抗性苦豆子內(nèi)生細菌的遺傳多樣性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（24）： 14673-14675.

[9] 張鑫，王婷，崔靈芝，等.苔蘚內(nèi)生菌Bacillus megaterium z12的分離、鑒定和抗菌活性篩選[J].中國抗生素雜志，2012，37（6）： 401-405，420.

[10] 林娜，游玲，郭華，等.山蒼子內(nèi)生細菌的分離及抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（6）： 3382-3384，3564.

果實發(fā)病程度分級方法如下，0 級：無??；1 級：病斑面積占果實面積的5%以下；3 級：病斑面積占果實面積的 6%～15%；5 級：病斑面積占果實面積的 16%～25%；7 級：病斑面積占果實面積的 26%～50%；9 級：病斑面積占果實面積的 50%以上。試驗數(shù)據(jù)采用DPS處理，進行差異顯著性分析。

病情指數(shù)= [∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)）/（調(diào)查總果數(shù)×9）]×100

防效=[（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株WYG5的鑒定

菌株WYG5在培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淺黃色，邊緣整齊，表面有凸狀隆起，干燥，不透明，革蘭氏染色陽性，芽孢染色陽性，菌體桿狀，周生鞭毛。菌株WYG5 的形態(tài)和生理生化特征與東秀珠等[6]描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）特征相同。對菌株WYG5的16S rDNA序列進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到 1 515 bp的堿基序列。將16S rDNA 序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它與多株巨大芽孢桿菌菌株的同源性均在99%以上。選取GenBank中的8株芽孢桿菌屬的細菌與菌株WYG5一起，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建出基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可以看出，菌株WYG5與巨大芽孢桿菌的同源性最高，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特征分析，確定菌株WYG5為巨大芽孢桿菌。

2.2菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性的測定

采用十字交叉法測定菌株WYG5對芒果炭疽病菌的皿內(nèi)拮抗活性，結(jié)果表明，該內(nèi)生細菌對芒果炭疽病菌有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中的擴展，抑制率達到32%。

2.3菌株WYG5對芒果的防病效果

內(nèi)生細菌WYG5的不同處理液對采后芒果的保鮮防病效果見表1。6 d相對于芒果保鮮來說時間較短，6 d時對照組病情指數(shù)僅為7.04，處理防效雖高但意義不大，故重點討論了9 d和12 d的防效。其中菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理9 d時的防效分別為60.76%和59.50%，不存在顯著差異；12 d時的防效分別為43.59%和34.19%，存在極顯著差異，發(fā)酵液的保鮮防病效果明顯優(yōu)于發(fā)酵濾液。稀釋10倍發(fā)酵液處理9 d時的防效為54.43%，與發(fā)酵液處理不存在顯著差異，而處理12 d時兩處理防效差異極顯著。稀釋10倍發(fā)酵濾液處理9 d和12 d時的防效均極顯著低于發(fā)酵濾液的防效。

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌作為植物內(nèi)生細菌已有報道，如農(nóng)倩等[7]從水稻體內(nèi)分離到一株巨大芽孢桿菌B196，對水稻紋枯病菌的生長具有較強的抑制作用，盆栽和田間防效分別為64.29%和55.13%；林天興等[8]從苦豆子中分離出48株對棉花枯萎病菌和黃萎病菌有較強拮抗作用的內(nèi)生細菌，并對其遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；張鑫等[9]從無紋紫背苔葉片中分離出一株內(nèi)生菌z12，鑒定為巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻紋枯病菌均有較強的抑制作用；林娜等[10]從山蒼子的根、莖、葉和果中分離出內(nèi)生細菌52株，其中一株對辣椒疫霉病的防治效果較好，且可促進辣椒植株生長。試驗從南酸棗中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析，鑒定將該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)測定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對采后芒果均有明顯的保鮮防病效果，處理9 d后防效分別為 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%，有關(guān)該菌的抗病機理及抑菌活性物質(zhì)還有待進一步研究。

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[8] 林天興，李超，龔明福.拮抗性苦豆子內(nèi)生細菌的遺傳多樣性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（24）： 14673-14675.

[9] 張鑫，王婷，崔靈芝，等.苔蘚內(nèi)生菌Bacillus megaterium z12的分離、鑒定和抗菌活性篩選[J].中國抗生素雜志，2012，37（6）： 401-405，420.

[10] 林娜，游玲，郭華，等.山蒼子內(nèi)生細菌的分離及抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（6）： 3382-3384，3564.

果實發(fā)病程度分級方法如下，0 級：無??；1 級：病斑面積占果實面積的5%以下；3 級：病斑面積占果實面積的 6%～15%；5 級：病斑面積占果實面積的 16%～25%；7 級：病斑面積占果實面積的 26%～50%；9 級：病斑面積占果實面積的 50%以上。試驗數(shù)據(jù)采用DPS處理，進行差異顯著性分析。

病情指數(shù)= [∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)）/（調(diào)查總果數(shù)×9）]×100

防效=[（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株WYG5的鑒定

菌株WYG5在培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淺黃色，邊緣整齊，表面有凸狀隆起，干燥，不透明，革蘭氏染色陽性，芽孢染色陽性，菌體桿狀，周生鞭毛。菌株WYG5 的形態(tài)和生理生化特征與東秀珠等[6]描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）特征相同。對菌株WYG5的16S rDNA序列進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到 1 515 bp的堿基序列。將16S rDNA 序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它與多株巨大芽孢桿菌菌株的同源性均在99%以上。選取GenBank中的8株芽孢桿菌屬的細菌與菌株WYG5一起，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建出基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可以看出，菌株WYG5與巨大芽孢桿菌的同源性最高，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特征分析，確定菌株WYG5為巨大芽孢桿菌。

2.2菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性的測定

采用十字交叉法測定菌株WYG5對芒果炭疽病菌的皿內(nèi)拮抗活性，結(jié)果表明，該內(nèi)生細菌對芒果炭疽病菌有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中的擴展，抑制率達到32%。

2.3菌株WYG5對芒果的防病效果

內(nèi)生細菌WYG5的不同處理液對采后芒果的保鮮防病效果見表1。6 d相對于芒果保鮮來說時間較短，6 d時對照組病情指數(shù)僅為7.04，處理防效雖高但意義不大，故重點討論了9 d和12 d的防效。其中菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理9 d時的防效分別為60.76%和59.50%，不存在顯著差異；12 d時的防效分別為43.59%和34.19%，存在極顯著差異，發(fā)酵液的保鮮防病效果明顯優(yōu)于發(fā)酵濾液。稀釋10倍發(fā)酵液處理9 d時的防效為54.43%，與發(fā)酵液處理不存在顯著差異，而處理12 d時兩處理防效差異極顯著。稀釋10倍發(fā)酵濾液處理9 d和12 d時的防效均極顯著低于發(fā)酵濾液的防效。

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌作為植物內(nèi)生細菌已有報道，如農(nóng)倩等[7]從水稻體內(nèi)分離到一株巨大芽孢桿菌B196，對水稻紋枯病菌的生長具有較強的抑制作用，盆栽和田間防效分別為64.29%和55.13%；林天興等[8]從苦豆子中分離出48株對棉花枯萎病菌和黃萎病菌有較強拮抗作用的內(nèi)生細菌，并對其遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；張鑫等[9]從無紋紫背苔葉片中分離出一株內(nèi)生菌z12，鑒定為巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻紋枯病菌均有較強的抑制作用；林娜等[10]從山蒼子的根、莖、葉和果中分離出內(nèi)生細菌52株，其中一株對辣椒疫霉病的防治效果較好，且可促進辣椒植株生長。試驗從南酸棗中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析，鑒定將該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)測定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對采后芒果均有明顯的保鮮防病效果，處理9 d后防效分別為 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%，有關(guān)該菌的抗病機理及抑菌活性物質(zhì)還有待進一步研究。

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