耐熱真菌產(chǎn)木聚糖酶的固體發(fā)酵條件

陳功+張巍+李思佳+熊海容

摘要：對(duì)嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）DSM 10635的固體培養(yǎng)基進(jìn)行改良。設(shè)計(jì)的間歇通氣的培養(yǎng)裝置，簡(jiǎn)化掉補(bǔ)水操作后，簡(jiǎn)化了操作并降低了培養(yǎng)基成本，單瓶玉米芯干粉量為120 g/L，增大了培養(yǎng)瓶的利用率，第5天菌絲已基本充滿整個(gè)培養(yǎng)體系，同時(shí)單批木聚糖酶活力最高為53 710 IU/g。

關(guān)鍵詞：木聚糖酶；固體發(fā)酵；間歇通氣；酶活力

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.3；TQ929文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2014）10-2395-03

Thermostable Xylanase Production with the Solid-state Fementation

CHEN Gong，ZHANG Wei，LI Si-jia，XIONG Hai-rong

（Engineering Research Centre of Bioresource in Southern China，College of Life Science，South-central University for Nationalities，

Wuhan 430074，China）

Abstract：Xylanase production with solid-state fementation of Thermomyces lanuginosus DSM 10635 was optimized. Under the water-saturated aeration device and the optimal culture media， the amount of corncob powder per bottle was 120 g/L. The utilization rate of culture bottle was increased. The mycelium filled up the whole culture system after 5 d and the xylanase productivity was up to 53 710 IU/g.

Key words： ylanases；solid state fermentation； intermittent ventilation； enzyme activity

基金項(xiàng)目：武漢市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013020501010180）

木聚糖酶（Xylanase，EC 3.2.1.8）是一種內(nèi)切β-1，4-木聚糖苷酶。這種酶水解半纖維素中的木聚糖（Xylan）為可代謝的低分子寡聚木糖，對(duì)疏松原材料組織結(jié)構(gòu)有重要意義[1-3]。嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）DSM 10635是一種耐熱型菌株，所產(chǎn)的木聚糖酶1YNA具有良好的耐熱性和熱穩(wěn)定性，能較好地應(yīng)用于酶法水解木聚糖的高溫處理過(guò)程[4，5]，能廣泛應(yīng)用于半纖維相關(guān)的燃料酒精工業(yè)、制漿造紙工業(yè)、飼料和食品工業(yè)。

目前，已有用基因工程的方法從Thermomyces lanuginosus DSM 10635中提取木聚糖酶基因片段導(dǎo)入畢赤酵母中高效表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)的研究[6，7]。但未見(jiàn)有該菌株固體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。固體發(fā)酵有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，所使用的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單便宜；原料不需糖化液化，處理簡(jiǎn)單；產(chǎn)物提取容易；固體發(fā)酵后的物料可直接作為產(chǎn)物；廢水排放量大大減少；單位體積的培養(yǎng)基生產(chǎn)能力高于液體培養(yǎng)基；不易污染雜菌；設(shè)備簡(jiǎn)單等。試驗(yàn)借鑒已報(bào)道的最適pH，最適培養(yǎng)溫度等條件[8，9]，從適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的角度對(duì)Thermomyces lanuginosus DSM 10635的固體發(fā)酵條件進(jìn)行改良。

1材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

1.1.1原料與試劑 玉米芯，菌種為T(mén)hermomyces lanuginosus DSM 10635；3，5-二硝基水楊酸（DNS），標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液，0.5%木聚糖-磷酸緩沖液（pH 6.5），檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 6.5）。其他所用藥品均為分析純。

1.1.2培養(yǎng)基液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDA）；玉米芯固體培養(yǎng)基：將玉米芯粉碎成粉末，稱120 g玉米芯干粉于1 L錐形瓶中，按料液比1∶3（g∶mL）添加培養(yǎng)液，在121 ℃下滅菌20 min，靜置冷卻。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)裝置試驗(yàn)裝置示意圖如圖1所示。

1.2.2培養(yǎng)基廉價(jià)化修改修改后的培養(yǎng)基各成分見(jiàn)表1。

1.2.3培養(yǎng)方法

1）菌種活化。挑取實(shí)驗(yàn)室保存的Thermomyces lanuginosus DSM 10635菌種于去離子水中制成懸浮液，并對(duì)懸浮液稀釋后進(jìn)行平板涂布，在50 ℃下培養(yǎng)3 d后，置于4 ℃下保藏。

2）種子液的制備。挑取上述平板的單菌落接種于PDA培養(yǎng)基中，于50 ℃ 200 r/min條件下培養(yǎng)3 d，接種于玉米芯固體培養(yǎng)基。

3）固體發(fā)酵。每份固體培養(yǎng)基按約10%（V/W）的接種量匯總，放入電控恒溫培養(yǎng)箱中50 ℃培養(yǎng)，每隔12 h通氣15 min，每隔24 h搖晃錐形瓶一次。

4）培養(yǎng)基含水率的計(jì)算。培養(yǎng)7 d后，于超凈工作臺(tái)上從錐形瓶中取出少量培養(yǎng)基，置于相應(yīng)的干凈培養(yǎng)皿中。取樣后將錐形瓶放入電控恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將盛有樣品的培養(yǎng)皿放入電熱恒溫干燥箱中于60 ℃下烘干約24 h，直至質(zhì)量不再發(fā)生變化，即得到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的絕干重，并記錄其重量以計(jì)算含水率。培養(yǎng)第9天重復(fù)上述操作。

5）粗酶液的提取。稱取烘干后的培養(yǎng)基放入250 mL的錐形瓶，加入100 mL檸檬酸磷酸緩沖液（pH 6.5），放入搖床在160 r/min，50 ℃條件搖瓶10 h，得上清液即為粗酶液。

1.2.4酶活力測(cè)定1個(gè)國(guó)際酶活力單位：在60 ℃和pH 6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量，還原糖以木糖為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定酶活力[6]。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基改良后生長(zhǎng)狀況

圖2為培養(yǎng)基改良前后培養(yǎng)5 d后的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明嗜熱真菌DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，第5天菌絲已基本充滿整個(gè)培養(yǎng)體系。

2.2固體發(fā)酵失水量記錄

在改良后的固體培養(yǎng)體系下，三角瓶?jī)?nèi)含水率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不斷降低，發(fā)酵7 d后含水率為58%，9 d后含水率為52%（圖3），表明培養(yǎng)基瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤(rùn)空氣的方法，很大程度上保持了培養(yǎng)基含水率，使發(fā)酵條件始終處在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

2.3酶活力測(cè)定結(jié)果

由于固體發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)成分分布不均一，菌種生長(zhǎng)代謝不均一，同等條件下做了3批試驗(yàn)。培養(yǎng)到第7天和第9天時(shí)檢測(cè)酶活力（圖4）。由圖4可知，3批發(fā)酵試驗(yàn)平均酶活力為34 831 IU/g，單批試驗(yàn)最高酶活力達(dá)到53 710 IU/g。

3小結(jié)與討論

利用DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生產(chǎn)木聚糖酶，其酶活力單批最高可提高到53 710 IU/g，這一酶活力也是目前國(guó)內(nèi)較高水平，同時(shí)由于同體積的三角瓶中培養(yǎng)基增加了1倍，單瓶產(chǎn)酶能力得以提高。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的間歇通氣的固體發(fā)酵方法，簡(jiǎn)化了發(fā)酵步驟，培養(yǎng)基的廉價(jià)優(yōu)化降低了培養(yǎng)基成本，這些結(jié)果對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有積極的意義。

利用DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生產(chǎn)木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培養(yǎng)液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生長(zhǎng)的多種無(wú)機(jī)鹽，使菌株在固體培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累；間隔通氣的試驗(yàn)裝置為菌株生長(zhǎng)代謝提供了更多的氧氣，同時(shí)也提高了培養(yǎng)基的傳熱效率，避免了因代謝產(chǎn)熱而導(dǎo)致的局部高溫對(duì)木聚糖酶活力的影響；每天補(bǔ)水不但加大了試驗(yàn)操作的復(fù)雜程度，帶來(lái)染菌風(fēng)險(xiǎn)，而且會(huì)使得固體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分分布不均衡，影響菌株生長(zhǎng)，采用在培養(yǎng)瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤(rùn)空氣的方法，很大程度上保持了培養(yǎng)基含水率，使發(fā)酵條件始終處在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)：

[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.

[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.

[3] 張繼泰，曾小英，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶與稀酸聯(lián)合水解甜菜渣生產(chǎn)L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（4）：50-53.

[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.

[5] 農(nóng)旭華，張繼泰，王玉瑛，等.嗜熱真菌DSM 10635生產(chǎn)耐熱木聚糖酶的小試研究[J].工業(yè)微生物，2009（3）：62-66.

[6] 李思佳，王亞偉，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶 1YNA 及其雙硫鍵突變體在畢赤酵母中的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2013，33（3）：74-79.

[7] 江正強(qiáng)，李里特，李穎.耐熱木聚糖酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23（8）：47-51.

[8] SONIA K G，CHADHA B S，SAINI H S.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3） under solid-state fermentation[J]. Bioresource Technology，2005， 96（14）：1561-1569.

[9] 周薇薇，尹亞輝，趙長(zhǎng)新.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶工藝[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（3）：176-179.

1.2.4酶活力測(cè)定1個(gè)國(guó)際酶活力單位：在60 ℃和pH 6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量，還原糖以木糖為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定酶活力[6]。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基改良后生長(zhǎng)狀況

圖2為培養(yǎng)基改良前后培養(yǎng)5 d后的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明嗜熱真菌DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，第5天菌絲已基本充滿整個(gè)培養(yǎng)體系。

2.2固體發(fā)酵失水量記錄

在改良后的固體培養(yǎng)體系下，三角瓶?jī)?nèi)含水率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不斷降低，發(fā)酵7 d后含水率為58%，9 d后含水率為52%（圖3），表明培養(yǎng)基瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤(rùn)空氣的方法，很大程度上保持了培養(yǎng)基含水率，使發(fā)酵條件始終處在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

2.3酶活力測(cè)定結(jié)果

由于固體發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)成分分布不均一，菌種生長(zhǎng)代謝不均一，同等條件下做了3批試驗(yàn)。培養(yǎng)到第7天和第9天時(shí)檢測(cè)酶活力（圖4）。由圖4可知，3批發(fā)酵試驗(yàn)平均酶活力為34 831 IU/g，單批試驗(yàn)最高酶活力達(dá)到53 710 IU/g。

3小結(jié)與討論

利用DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生產(chǎn)木聚糖酶，其酶活力單批最高可提高到53 710 IU/g，這一酶活力也是目前國(guó)內(nèi)較高水平，同時(shí)由于同體積的三角瓶中培養(yǎng)基增加了1倍，單瓶產(chǎn)酶能力得以提高。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的間歇通氣的固體發(fā)酵方法，簡(jiǎn)化了發(fā)酵步驟，培養(yǎng)基的廉價(jià)優(yōu)化降低了培養(yǎng)基成本，這些結(jié)果對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有積極的意義。

利用DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生產(chǎn)木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培養(yǎng)液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生長(zhǎng)的多種無(wú)機(jī)鹽，使菌株在固體培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累；間隔通氣的試驗(yàn)裝置為菌株生長(zhǎng)代謝提供了更多的氧氣，同時(shí)也提高了培養(yǎng)基的傳熱效率，避免了因代謝產(chǎn)熱而導(dǎo)致的局部高溫對(duì)木聚糖酶活力的影響；每天補(bǔ)水不但加大了試驗(yàn)操作的復(fù)雜程度，帶來(lái)染菌風(fēng)險(xiǎn)，而且會(huì)使得固體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分分布不均衡，影響菌株生長(zhǎng)，采用在培養(yǎng)瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤(rùn)空氣的方法，很大程度上保持了培養(yǎng)基含水率，使發(fā)酵條件始終處在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)：

[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.

[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.

[3] 張繼泰，曾小英，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶與稀酸聯(lián)合水解甜菜渣生產(chǎn)L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（4）：50-53.

[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.

[5] 農(nóng)旭華，張繼泰，王玉瑛，等.嗜熱真菌DSM 10635生產(chǎn)耐熱木聚糖酶的小試研究[J].工業(yè)微生物，2009（3）：62-66.

[6] 李思佳，王亞偉，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶 1YNA 及其雙硫鍵突變體在畢赤酵母中的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2013，33（3）：74-79.

[7] 江正強(qiáng)，李里特，李穎.耐熱木聚糖酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23（8）：47-51.

[8] SONIA K G，CHADHA B S，SAINI H S.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3） under solid-state fermentation[J]. Bioresource Technology，2005， 96（14）：1561-1569.

[9] 周薇薇，尹亞輝，趙長(zhǎng)新.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶工藝[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（3）：176-179.

1.2.4酶活力測(cè)定1個(gè)國(guó)際酶活力單位：在60 ℃和pH 6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量，還原糖以木糖為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定酶活力[6]。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基改良后生長(zhǎng)狀況

圖2為培養(yǎng)基改良前后培養(yǎng)5 d后的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明嗜熱真菌DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，第5天菌絲已基本充滿整個(gè)培養(yǎng)體系。

2.2固體發(fā)酵失水量記錄

在改良后的固體培養(yǎng)體系下，三角瓶?jī)?nèi)含水率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加不斷降低，發(fā)酵7 d后含水率為58%，9 d后含水率為52%（圖3），表明培養(yǎng)基瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤(rùn)空氣的方法，很大程度上保持了培養(yǎng)基含水率，使發(fā)酵條件始終處在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

2.3酶活力測(cè)定結(jié)果

由于固體發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)成分分布不均一，菌種生長(zhǎng)代謝不均一，同等條件下做了3批試驗(yàn)。培養(yǎng)到第7天和第9天時(shí)檢測(cè)酶活力（圖4）。由圖4可知，3批發(fā)酵試驗(yàn)平均酶活力為34 831 IU/g，單批試驗(yàn)最高酶活力達(dá)到53 710 IU/g。

3小結(jié)與討論

利用DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生產(chǎn)木聚糖酶，其酶活力單批最高可提高到53 710 IU/g，這一酶活力也是目前國(guó)內(nèi)較高水平，同時(shí)由于同體積的三角瓶中培養(yǎng)基增加了1倍，單瓶產(chǎn)酶能力得以提高。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的間歇通氣的固體發(fā)酵方法，簡(jiǎn)化了發(fā)酵步驟，培養(yǎng)基的廉價(jià)優(yōu)化降低了培養(yǎng)基成本，這些結(jié)果對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有積極的意義。

利用DSM 10635在改良后的培養(yǎng)基上生產(chǎn)木聚糖酶活力的大幅度提高，原因可能是培養(yǎng)液中添加了少量的葡萄糖以及真菌生長(zhǎng)的多種無(wú)機(jī)鹽，使菌株在固體培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累；間隔通氣的試驗(yàn)裝置為菌株生長(zhǎng)代謝提供了更多的氧氣，同時(shí)也提高了培養(yǎng)基的傳熱效率，避免了因代謝產(chǎn)熱而導(dǎo)致的局部高溫對(duì)木聚糖酶活力的影響；每天補(bǔ)水不但加大了試驗(yàn)操作的復(fù)雜程度，帶來(lái)染菌風(fēng)險(xiǎn)，而且會(huì)使得固體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分分布不均衡，影響菌株生長(zhǎng)，采用在培養(yǎng)瓶口塞加厚棉塞，間歇通入濕潤(rùn)空氣的方法，很大程度上保持了培養(yǎng)基含水率，使發(fā)酵條件始終處在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)：

[1] XIONG H R，WEYMARN N V，TURUNEN O，et al. Xylanase production by trichoderma reesei rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates[J].Bioresource Technology，2005，96（7）：753-759.

[2] SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A. Thermomyces lanuginosus： properties of strains and their hemicellulases[J].FEMS Microbiol Rev ，2003，27（1）：3-16.

[3] 張繼泰，曾小英，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶與稀酸聯(lián)合水解甜菜渣生產(chǎn)L-阿拉伯糖的初步研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（4）：50-53.

[4] XIONG H R，NYYSSOLA A，JANIS J，et al. Characterization of the xylanase produced by submerged cultivation by Thermomyces lanuginosus DSM 10635[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：93-99.

[5] 農(nóng)旭華，張繼泰，王玉瑛，等.嗜熱真菌DSM 10635生產(chǎn)耐熱木聚糖酶的小試研究[J].工業(yè)微生物，2009（3）：62-66.

[6] 李思佳，王亞偉，付正，等.嗜熱真菌木聚糖酶 1YNA 及其雙硫鍵突變體在畢赤酵母中的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2013，33（3）：74-79.

[7] 江正強(qiáng)，李里特，李穎.耐熱木聚糖酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23（8）：47-51.

[8] SONIA K G，CHADHA B S，SAINI H S.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3） under solid-state fermentation[J]. Bioresource Technology，2005， 96（14）：1561-1569.

[9] 周薇薇，尹亞輝，趙長(zhǎng)新.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶工藝[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（3）：176-179.