甜椒無菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李妹芳　苗紀(jì)忠　卜祥勇等

摘要：以茄門甜椒種子為試材，對(duì)無菌苗培養(yǎng)前的種子消毒劑種類及不同消毒時(shí)間、濃度等的消毒效果進(jìn)行了比較研究；對(duì)影響無菌苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方、pH值及生長(zhǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，甜椒無菌苗的最佳消毒流程和生長(zhǎng)條件為：55℃無菌水浸種15 min，室溫靜置4～5 h，用10% NaClO消毒30 min，無菌水沖洗3次，接種至1/2MS 培養(yǎng)基+15 g/L蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH值為5.8，（25 ± 1）℃，子葉長(zhǎng)出6～10 d左右，即可作為轉(zhuǎn)基因用無菌苗。

關(guān)鍵詞：甜椒；無菌苗；生長(zhǎng)條件

中圖分類號(hào)：S641.304+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）07-0034-03

AbstractUsing Qiemen sweet pepper as materials， the disinfection effects of different disinfectant agents， disinfection times and contents on seeds before culture were compared， and the effects of medium formula， pH value and growth time on growth of aseptic seedling were investigated. The results showed that the optimum disinfection method and culture conditions for aseptic sweet pepper seedling were soaking seeds in aseptic water of 55℃ for 15 minutes， then staying at room temperature for 4～5 hours， disinfecting with 10% NaClO for 30 minutes， washing 3 times with aseptic water and then culturing in medium of 1/2MS+15 g/L sugar+7.5 g/L agar with pH value of 5.8 under （25±1）℃. When the cotyledon sprouted for 6～10 days， the seedlings could be used for genetic transformation.

Key wordsSweet pepper； Aseptic seedling； Growth condition

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，組培快繁成為甜椒雜交優(yōu)勢(shì)固定、優(yōu)良品種快速繁殖、突變體保存利用及基因轉(zhuǎn)移所必需的有效手段。在組培快繁過程中，有效的消毒程序是獲得健壯無菌苗有效開展轉(zhuǎn)基因研究及其它組培試驗(yàn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。國內(nèi)外研究者對(duì)種子的消毒做了許多試驗(yàn)，但藥品種類、濃度﹑消毒方法等差異較大，一般用兩種以上的消毒劑[1～3]，過程煩瑣，污染率高，且多用HgCl2 消毒，無菌苗活力較弱，污染環(huán)境，危害人體健康。

我們?cè)诶棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行甜椒遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，結(jié)合具體的試驗(yàn)條件，應(yīng)用NaClO對(duì)甜椒無菌苗進(jìn)行消毒處理，優(yōu)化消毒流程，與文獻(xiàn)中普遍采用的HgCl2消毒流程[2]進(jìn)行了比較試驗(yàn)，并對(duì)無菌苗的最佳生長(zhǎng)條件進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1供試材料

茄門甜椒種子。選籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的健康種子150 g，每處理50粒種子。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1消毒劑的選擇 NaClO消毒程序的優(yōu)化：NaClO 濃度分別為5%、10%、15%，消毒時(shí)間為20、30、40 min，水洗次數(shù)為1、2、3、5次的三因素多水平試驗(yàn)。

消毒方法比較：先做兩因素處理，無菌水55℃水浴15 min，室溫靜置4～5 h后，一組用75%酒精進(jìn)行消毒1～2 min，另一組則不用。每組再分為兩組，分別用10%NaClO消毒30 min和0.1%HgCl2 消毒5 min，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)3次。分析無菌苗各生長(zhǎng)指標(biāo)：須根數(shù)、苗高、直徑、子葉長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)、種子萌發(fā)率。

1.2.2培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化培養(yǎng)基為MS和1/2 MS 兩個(gè)水平；pH值為5.8 和5.5 兩個(gè)水平；子葉長(zhǎng)出3、6、10 d，觀察統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)3次。

1.3培養(yǎng)條件

接種后，在1 600～2 000 lx光照條件下培養(yǎng)16 h，溫度為（25±1）℃。

2結(jié)果與分析

2.1消毒劑的選擇

2.1.1NaClO消毒程序的優(yōu)化由表1可以看出， 不同濃度和消毒時(shí)間，均以10%NaClO消毒30 min處理效果最好，污染率為0，相對(duì)萌發(fā)率和成苗率均達(dá)93.33%。5%NaClO處理消毒效果差，污染率高；消毒40 min處理，甜椒種子顏色雪白，污染率雖不高，但萌發(fā)率和成苗率均較低。水洗結(jié)果觀察顯示，用無菌水沖洗1～2 次無菌苗長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，沖洗3次無菌苗生長(zhǎng)旺盛，因此，以無菌水沖洗3次為宜。

3結(jié)論

健壯無菌苗的獲得，消毒劑的選擇應(yīng)用非常關(guān)鍵。目前種子的消毒普遍使用0.1%HgCl2為主要消毒劑，但在本試驗(yàn)甜椒無菌苗的培養(yǎng)中，10% NaClO消毒效果優(yōu)于0.1% HgCl2，染菌率低。另外，合適的消毒方法及培養(yǎng)條件等因素也是獲得健壯無菌苗的重要條件。試驗(yàn)表明，獲得健壯無菌苗的最佳方案為：選取籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的種子→55℃無菌水水浴15 min→室溫靜置4～5 h→10%NaClO消毒30 min→無菌水清洗3次→接種至培養(yǎng)基：1/2 MS+15 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂，pH 5.8 →25℃、16 h光照培養(yǎng)，子葉長(zhǎng)出6～10 d左右，即可作為組織培養(yǎng)用無菌苗。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang Y W， Yang M Z， Pan N S， et al. Plant regeneration and transformation of sweet pepper （Capsicum frutescens）[J]. Acta Bot. Sin. ，1991， 33（10）：780-786.

[2]Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol.Plant，1962，15：473-497.

[3]Kumar A M，Reddy K N，Sreenvathsa R，et al.Towards crop improvement in bell pepper（Capsicum annuum L.）：Transgenics （uid A：：hpt Ⅱ） by a tissue-culture-independent Agrobacterium-mediated in planta approach[J].Scientia Horticulture，2009，119：362-370.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2014，46（7）：51～54Shandong Agricultural Sciences

摘要：以茄門甜椒種子為試材，對(duì)無菌苗培養(yǎng)前的種子消毒劑種類及不同消毒時(shí)間、濃度等的消毒效果進(jìn)行了比較研究；對(duì)影響無菌苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方、pH值及生長(zhǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，甜椒無菌苗的最佳消毒流程和生長(zhǎng)條件為：55℃無菌水浸種15 min，室溫靜置4～5 h，用10% NaClO消毒30 min，無菌水沖洗3次，接種至1/2MS 培養(yǎng)基+15 g/L蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH值為5.8，（25 ± 1）℃，子葉長(zhǎng)出6～10 d左右，即可作為轉(zhuǎn)基因用無菌苗。

關(guān)鍵詞：甜椒；無菌苗；生長(zhǎng)條件

中圖分類號(hào)：S641.304+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）07-0034-03

AbstractUsing Qiemen sweet pepper as materials， the disinfection effects of different disinfectant agents， disinfection times and contents on seeds before culture were compared， and the effects of medium formula， pH value and growth time on growth of aseptic seedling were investigated. The results showed that the optimum disinfection method and culture conditions for aseptic sweet pepper seedling were soaking seeds in aseptic water of 55℃ for 15 minutes， then staying at room temperature for 4～5 hours， disinfecting with 10% NaClO for 30 minutes， washing 3 times with aseptic water and then culturing in medium of 1/2MS+15 g/L sugar+7.5 g/L agar with pH value of 5.8 under （25±1）℃. When the cotyledon sprouted for 6～10 days， the seedlings could be used for genetic transformation.

Key wordsSweet pepper； Aseptic seedling； Growth condition

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，組培快繁成為甜椒雜交優(yōu)勢(shì)固定、優(yōu)良品種快速繁殖、突變體保存利用及基因轉(zhuǎn)移所必需的有效手段。在組培快繁過程中，有效的消毒程序是獲得健壯無菌苗有效開展轉(zhuǎn)基因研究及其它組培試驗(yàn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。國內(nèi)外研究者對(duì)種子的消毒做了許多試驗(yàn)，但藥品種類、濃度﹑消毒方法等差異較大，一般用兩種以上的消毒劑[1～3]，過程煩瑣，污染率高，且多用HgCl2 消毒，無菌苗活力較弱，污染環(huán)境，危害人體健康。

我們?cè)诶棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行甜椒遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，結(jié)合具體的試驗(yàn)條件，應(yīng)用NaClO對(duì)甜椒無菌苗進(jìn)行消毒處理，優(yōu)化消毒流程，與文獻(xiàn)中普遍采用的HgCl2消毒流程[2]進(jìn)行了比較試驗(yàn)，并對(duì)無菌苗的最佳生長(zhǎng)條件進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1供試材料

茄門甜椒種子。選籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的健康種子150 g，每處理50粒種子。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1消毒劑的選擇 NaClO消毒程序的優(yōu)化：NaClO 濃度分別為5%、10%、15%，消毒時(shí)間為20、30、40 min，水洗次數(shù)為1、2、3、5次的三因素多水平試驗(yàn)。

消毒方法比較：先做兩因素處理，無菌水55℃水浴15 min，室溫靜置4～5 h后，一組用75%酒精進(jìn)行消毒1～2 min，另一組則不用。每組再分為兩組，分別用10%NaClO消毒30 min和0.1%HgCl2 消毒5 min，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)3次。分析無菌苗各生長(zhǎng)指標(biāo)：須根數(shù)、苗高、直徑、子葉長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)、種子萌發(fā)率。

1.2.2培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化培養(yǎng)基為MS和1/2 MS 兩個(gè)水平；pH值為5.8 和5.5 兩個(gè)水平；子葉長(zhǎng)出3、6、10 d，觀察統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)3次。

1.3培養(yǎng)條件

接種后，在1 600～2 000 lx光照條件下培養(yǎng)16 h，溫度為（25±1）℃。

2結(jié)果與分析

2.1消毒劑的選擇

2.1.1NaClO消毒程序的優(yōu)化由表1可以看出， 不同濃度和消毒時(shí)間，均以10%NaClO消毒30 min處理效果最好，污染率為0，相對(duì)萌發(fā)率和成苗率均達(dá)93.33%。5%NaClO處理消毒效果差，污染率高；消毒40 min處理，甜椒種子顏色雪白，污染率雖不高，但萌發(fā)率和成苗率均較低。水洗結(jié)果觀察顯示，用無菌水沖洗1～2 次無菌苗長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，沖洗3次無菌苗生長(zhǎng)旺盛，因此，以無菌水沖洗3次為宜。

3結(jié)論

健壯無菌苗的獲得，消毒劑的選擇應(yīng)用非常關(guān)鍵。目前種子的消毒普遍使用0.1%HgCl2為主要消毒劑，但在本試驗(yàn)甜椒無菌苗的培養(yǎng)中，10% NaClO消毒效果優(yōu)于0.1% HgCl2，染菌率低。另外，合適的消毒方法及培養(yǎng)條件等因素也是獲得健壯無菌苗的重要條件。試驗(yàn)表明，獲得健壯無菌苗的最佳方案為：選取籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的種子→55℃無菌水水浴15 min→室溫靜置4～5 h→10%NaClO消毒30 min→無菌水清洗3次→接種至培養(yǎng)基：1/2 MS+15 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂，pH 5.8 →25℃、16 h光照培養(yǎng)，子葉長(zhǎng)出6～10 d左右，即可作為組織培養(yǎng)用無菌苗。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang Y W， Yang M Z， Pan N S， et al. Plant regeneration and transformation of sweet pepper （Capsicum frutescens）[J]. Acta Bot. Sin. ，1991， 33（10）：780-786.

[2]Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol.Plant，1962，15：473-497.

[3]Kumar A M，Reddy K N，Sreenvathsa R，et al.Towards crop improvement in bell pepper（Capsicum annuum L.）：Transgenics （uid A：：hpt Ⅱ） by a tissue-culture-independent Agrobacterium-mediated in planta approach[J].Scientia Horticulture，2009，119：362-370.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2014，46（7）：51～54Shandong Agricultural Sciences

摘要：以茄門甜椒種子為試材，對(duì)無菌苗培養(yǎng)前的種子消毒劑種類及不同消毒時(shí)間、濃度等的消毒效果進(jìn)行了比較研究；對(duì)影響無菌苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方、pH值及生長(zhǎng)時(shí)間等因素進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，甜椒無菌苗的最佳消毒流程和生長(zhǎng)條件為：55℃無菌水浸種15 min，室溫靜置4～5 h，用10% NaClO消毒30 min，無菌水沖洗3次，接種至1/2MS 培養(yǎng)基+15 g/L蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH值為5.8，（25 ± 1）℃，子葉長(zhǎng)出6～10 d左右，即可作為轉(zhuǎn)基因用無菌苗。

關(guān)鍵詞：甜椒；無菌苗；生長(zhǎng)條件

中圖分類號(hào)：S641.304+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）07-0034-03

AbstractUsing Qiemen sweet pepper as materials， the disinfection effects of different disinfectant agents， disinfection times and contents on seeds before culture were compared， and the effects of medium formula， pH value and growth time on growth of aseptic seedling were investigated. The results showed that the optimum disinfection method and culture conditions for aseptic sweet pepper seedling were soaking seeds in aseptic water of 55℃ for 15 minutes， then staying at room temperature for 4～5 hours， disinfecting with 10% NaClO for 30 minutes， washing 3 times with aseptic water and then culturing in medium of 1/2MS+15 g/L sugar+7.5 g/L agar with pH value of 5.8 under （25±1）℃. When the cotyledon sprouted for 6～10 days， the seedlings could be used for genetic transformation.

Key wordsSweet pepper； Aseptic seedling； Growth condition

近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，組培快繁成為甜椒雜交優(yōu)勢(shì)固定、優(yōu)良品種快速繁殖、突變體保存利用及基因轉(zhuǎn)移所必需的有效手段。在組培快繁過程中，有效的消毒程序是獲得健壯無菌苗有效開展轉(zhuǎn)基因研究及其它組培試驗(yàn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。國內(nèi)外研究者對(duì)種子的消毒做了許多試驗(yàn)，但藥品種類、濃度﹑消毒方法等差異較大，一般用兩種以上的消毒劑[1～3]，過程煩瑣，污染率高，且多用HgCl2 消毒，無菌苗活力較弱，污染環(huán)境，危害人體健康。

我們?cè)诶棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行甜椒遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，結(jié)合具體的試驗(yàn)條件，應(yīng)用NaClO對(duì)甜椒無菌苗進(jìn)行消毒處理，優(yōu)化消毒流程，與文獻(xiàn)中普遍采用的HgCl2消毒流程[2]進(jìn)行了比較試驗(yàn)，并對(duì)無菌苗的最佳生長(zhǎng)條件進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1供試材料

茄門甜椒種子。選籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的健康種子150 g，每處理50粒種子。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1消毒劑的選擇 NaClO消毒程序的優(yōu)化：NaClO 濃度分別為5%、10%、15%，消毒時(shí)間為20、30、40 min，水洗次數(shù)為1、2、3、5次的三因素多水平試驗(yàn)。

消毒方法比較：先做兩因素處理，無菌水55℃水浴15 min，室溫靜置4～5 h后，一組用75%酒精進(jìn)行消毒1～2 min，另一組則不用。每組再分為兩組，分別用10%NaClO消毒30 min和0.1%HgCl2 消毒5 min，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)3次。分析無菌苗各生長(zhǎng)指標(biāo)：須根數(shù)、苗高、直徑、子葉長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)、種子萌發(fā)率。

1.2.2培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化培養(yǎng)基為MS和1/2 MS 兩個(gè)水平；pH值為5.8 和5.5 兩個(gè)水平；子葉長(zhǎng)出3、6、10 d，觀察統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)3次。

1.3培養(yǎng)條件

接種后，在1 600～2 000 lx光照條件下培養(yǎng)16 h，溫度為（25±1）℃。

2結(jié)果與分析

2.1消毒劑的選擇

2.1.1NaClO消毒程序的優(yōu)化由表1可以看出， 不同濃度和消毒時(shí)間，均以10%NaClO消毒30 min處理效果最好，污染率為0，相對(duì)萌發(fā)率和成苗率均達(dá)93.33%。5%NaClO處理消毒效果差，污染率高；消毒40 min處理，甜椒種子顏色雪白，污染率雖不高，但萌發(fā)率和成苗率均較低。水洗結(jié)果觀察顯示，用無菌水沖洗1～2 次無菌苗長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，沖洗3次無菌苗生長(zhǎng)旺盛，因此，以無菌水沖洗3次為宜。

3結(jié)論

健壯無菌苗的獲得，消毒劑的選擇應(yīng)用非常關(guān)鍵。目前種子的消毒普遍使用0.1%HgCl2為主要消毒劑，但在本試驗(yàn)甜椒無菌苗的培養(yǎng)中，10% NaClO消毒效果優(yōu)于0.1% HgCl2，染菌率低。另外，合適的消毒方法及培養(yǎng)條件等因素也是獲得健壯無菌苗的重要條件。試驗(yàn)表明，獲得健壯無菌苗的最佳方案為：選取籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的種子→55℃無菌水水浴15 min→室溫靜置4～5 h→10%NaClO消毒30 min→無菌水清洗3次→接種至培養(yǎng)基：1/2 MS+15 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂，pH 5.8 →25℃、16 h光照培養(yǎng)，子葉長(zhǎng)出6～10 d左右，即可作為組織培養(yǎng)用無菌苗。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang Y W， Yang M Z， Pan N S， et al. Plant regeneration and transformation of sweet pepper （Capsicum frutescens）[J]. Acta Bot. Sin. ，1991， 33（10）：780-786.

[2]Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol.Plant，1962，15：473-497.

[3]Kumar A M，Reddy K N，Sreenvathsa R，et al.Towards crop improvement in bell pepper（Capsicum annuum L.）：Transgenics （uid A：：hpt Ⅱ） by a tissue-culture-independent Agrobacterium-mediated in planta approach[J].Scientia Horticulture，2009，119：362-370.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2014，46（7）：51～54Shandong Agricultural Sciences