多氯聯(lián)苯對我國土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)

程金金，宋靜,*，呂明超，王興祥

1. 中國科學(xué)院南京土壤研究所 土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室，南京 210008 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

多氯聯(lián)苯對我國土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)

程金金1,2，宋靜1,2,*，呂明超1,2，王興祥1,2

1. 中國科學(xué)院南京土壤研究所 土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室，南京 210008 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

作為持久性有機污染物(POPs)，多氯聯(lián)苯(PCBs)一旦進(jìn)入土壤將長期存留并對土棲生物產(chǎn)生潛在危害。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，研究外源PCBs對土壤微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)，篩選出指示PCBs污染的敏感指標(biāo)并獲取可靠的生態(tài)毒理數(shù)據(jù)十分重要。研究以江西紅壤和天津潮土為供試土壤，在室內(nèi)25 ℃連續(xù)培養(yǎng)28 d的條件下進(jìn)行了生態(tài)毒理實驗，選擇了微生物量碳、呼吸強度、代謝熵、硝化作用、脫氫酶活性、脲酶活性和微生物群落功能多樣性為微生物指標(biāo)。結(jié)果顯示：1) 在28 d培養(yǎng)時間內(nèi)，多氯聯(lián)苯(PCBs)的毒性作用隨培養(yǎng)時間的延長而增強，且在紅壤中的毒性作用強于在潮土中，表明PCBs對土壤微生物的毒性作用存在時間效應(yīng)并受土壤性質(zhì)的影響。2) 各微生物指標(biāo)的敏感性不同，微生物量碳、脲酶活性和微生物功能多樣性對PCBs污染反應(yīng)不夠敏感，而土壤呼吸強度、代謝熵、硝化作用和脫氫酶活性對PCBs污染反應(yīng)敏感。3) 14 d時，紅壤中PCBs對脫氫酶活性、呼吸強度和代謝熵的EC10值分別為1.20、3.18和1.09 mg·kg-1，而在潮土中分別為6.31、4.73和> 50 mg·kg-1；28 d時，紅壤中PCBs對硝化作用、脫氫酶活性、呼吸強度和代謝熵的EC10值分別為2.32、0.77、0.51和0.71 mg·kg-1，而在潮土中分別為5.91、1.65、3.00和> 50 mg·kg-1。綜合考慮經(jīng)濟和實際需要等因素，建議將呼吸強度、硝化作用和脫氫酶活性作為PCBs污染土壤生態(tài)毒理評價中的首選敏感指標(biāo)，并建議培養(yǎng)時間設(shè)置為28 d。

多氯聯(lián)苯(PCBs)；紅壤；潮土；土壤微生物；生態(tài)毒理

多氯聯(lián)苯(PCBs)是首批被《斯德哥爾摩公約》列入全球控制的12種持久性有機污染物(POPs)之一，具有潛在的毒性及致癌性。它的來源主要包括：廢舊變壓器中絕緣液的滲漏和揮發(fā)、焚燒含PCBs的物質(zhì)、增塑劑中PCBs的揮發(fā)、汽車尾氣排放和紙張漂白等[1]。土壤被認(rèn)為是PCBs最大的儲存庫，一旦進(jìn)入土壤，PCBs即被土壤有機質(zhì)牢固吸附，長期地存留于土壤環(huán)境中，對土壤生態(tài)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，非常有必要建立基于生態(tài)毒理學(xué)的土壤篩選值用于土壤PCBs污染的評價和篩查。然而，缺乏基于本國土壤的生態(tài)毒理數(shù)據(jù)已經(jīng)成為我國建立PCBs土壤生態(tài)篩選值的瓶頸問題。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分之一，不僅在推動土壤養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化和土壤有機質(zhì)的礦化分解等方面起到重要作用，還能較敏感地反映出土壤環(huán)境的細(xì)微變化[2]，可以作為指示土壤污染的敏感受體[3]。因此，以土壤微生物為生態(tài)受體的PCBs生態(tài)毒理數(shù)據(jù)是PCBs生態(tài)毒理數(shù)據(jù)庫重要的組成部分。在土壤微生物生態(tài)毒理實驗中常用的微生物指標(biāo)主要包括4類：微生物量、微生物生理生化過程、酶活性和微生物多樣性[4]。PCBs對其中一些指標(biāo)的影響已有報道，例如，土壤微生物量[5-7]、呼吸強度[5-7]、代謝熵[5]、酶活性[7]和微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性[8]。然而，在同一供試土壤和實驗條件下PCBs對4類微生物指標(biāo)的綜合研究及敏感性比較鮮有報道。此外，由于PCBs單體的選擇、濃度梯度和培養(yǎng)時間的設(shè)定等實驗細(xì)節(jié)以及毒理數(shù)據(jù)的給出形式等問題，導(dǎo)致了已有的研究結(jié)果很難直接應(yīng)用于PCBs土壤生態(tài)篩選值的推導(dǎo)中。

很多國家(如美國、澳大利亞、加拿大等)，PCBs的土壤篩選值或土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是以PCBs總量的形式給出的。理論上，PCBs包含209種同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)上的差異直接導(dǎo)致其毒性的不同，其中12種具有共平面結(jié)構(gòu)的PCBs毒性最強[9]。對209種PCBs單體都進(jìn)行生態(tài)毒理實驗顯然是不現(xiàn)實的。但是，土壤PCBs污染具有一定的分布特征[10]，可以從中篩選出具有指示作用的PCBs單體組合進(jìn)行生態(tài)毒理實驗，這樣獲得的生態(tài)毒理數(shù)據(jù)可以近似表示土壤總PCBs的生態(tài)毒性效應(yīng)，具有很強的可操作性和適用性。在實驗設(shè)置方面，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization, ISO)、經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)以及我國國家標(biāo)準(zhǔn)化主管機構(gòu)已經(jīng)頒布了一些標(biāo)準(zhǔn)化的微生物測試方法(表1)[11-19]。這些標(biāo)準(zhǔn)方法對污染物濃度梯度和培養(yǎng)時間的設(shè)定等實驗細(xì)節(jié)進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定，參照這些標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實驗將增強數(shù)據(jù)的可靠性和可比性。此外，在毒理數(shù)據(jù)的給出形式方面，由于數(shù)據(jù)缺乏，歐盟、加拿大等國家和地區(qū)目前使用污染物的無可見效應(yīng)濃度(no observed effect concentration, NOEC)制定土壤生態(tài)篩選值。NOEC的定義是第一個與對照之間有顯著性差異的處理之前的處理濃度。它是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)的方法，檢驗處理與空白對照之間是否存在統(tǒng)計上的顯著性差異而得到。因此，NOEC很大程度上依賴于實驗的精度以及污染物濃度梯度的設(shè)置，若實驗精度不夠高或污染物濃度梯度較大都將導(dǎo)致NOEC值偏高。此外，NOEC值也不能體現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。目前，已有多位學(xué)者對NOEC值的有效性提出了質(zhì)疑[20-21]。而10%效應(yīng)濃度(EC10)是基于劑量效應(yīng)關(guān)系曲線求解得到，可以較準(zhǔn)確地反映污染物與測試指標(biāo)間的劑量效應(yīng)關(guān)系，美國國家環(huán)保局(U.S. Environmental Protection Agency, USEPA)和橡樹嶺國家實驗室(Oak Ridge National Laboratory, ORNL)等國家機構(gòu)和組織在制定土壤生態(tài)篩選值時已經(jīng)選用了EC10值。因此，采用標(biāo)準(zhǔn)化的實驗方法對指示性PCBs進(jìn)行毒理學(xué)實驗并獲得EC10值，將為PCBs的土壤生態(tài)篩選值的推導(dǎo)提供出更可靠和適用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表1 土壤微生物生態(tài)毒理測試標(biāo)準(zhǔn)方法匯總Table 1 Summary of standardized soil microbial ecotoxicological tests

紅壤和潮土分別是我國南方和北方典型的農(nóng)田土壤，潮土有機質(zhì)含量高且多為堿性，而紅壤有機質(zhì)含量低且多為酸性。由于2種土壤的基本理化性質(zhì)差異較大，微生物區(qū)系組成不同，相同劑量的PCBs進(jìn)入這2種土壤，可能會產(chǎn)生不同的生態(tài)毒理效應(yīng)，從而影響PCBs的毒性閾值。本文以微生物量碳、呼吸強度、代謝熵、硝化作用、脫氫酶活性、脲酶活性和微生物群落功能多樣性為微生物學(xué)指標(biāo)，采用等質(zhì)量的7種指示性PCBs單體(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180)組成PCBs混合物，對比研究室內(nèi)培養(yǎng)14 d和28 d時外源PCBs對紅壤和潮土微生物的生態(tài)毒理效應(yīng)，旨在探討土壤PCBs生態(tài)毒理效應(yīng)的影響因素，比較不同微生物指標(biāo)的敏感性差異并篩選出指示PCBs污染的敏感指標(biāo)，為建立我國標(biāo)準(zhǔn)化的PCBs土壤微生物生態(tài)毒理實驗方法提供依據(jù)。此外，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型對劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行擬合，求解出生態(tài)毒理參數(shù)EC10，為這2類土壤中PCBs生態(tài)篩選值的制定提供可靠的毒理數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試土壤

供試的2種土壤分別為采自中國科學(xué)院鷹潭紅壤生態(tài)實驗站的紅壤(N：28°12'，E：116°55')和天津市寧河縣百利農(nóng)業(yè)示范基地的潮土(N：39°23'，E：117°51')，土樣未受PCBs污染，理化性質(zhì)見表2。土樣采自表層0～20 cm，過2 mm篩并去除植物根系后，放置于4 ℃冷庫中保存?zhèn)溆?。在實驗? d，將含水量調(diào)節(jié)至田間最大持水量的50%，置于25 ℃的人工氣候箱中預(yù)培養(yǎng)，以恢復(fù)土壤微生物的活性。

1.2 實驗處理

實驗所用PCBs為等質(zhì)量的7種指示性單體組成的混合物。這7種單體分別為：PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180 (>99%，美國Accustandard公司)。實驗設(shè)7個濃度處理，分別為0、0.25、0.5、1、5、10、50 mg·kg-1，每個處理設(shè)4次重復(fù)。PCBs以丙酮溶液的形式按預(yù)設(shè)濃度先加入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的土樣中，混勻并置于通風(fēng)櫥中待丙酮揮發(fā)完全后，將其與其余90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的土樣充分?jǐn)嚢杌靹?，調(diào)節(jié)含水量至田間最大持水量的50%，置于玻璃燒杯中，蓋上具有透氣作用的封口膜以保持好氧條件，于25 ℃人工氣候箱中恒溫培養(yǎng)。每隔3 d用稱重法補充損失的水分。

1.3 測試指標(biāo)

代謝熵由呼吸強度與微生物量碳的比值求得，其余指標(biāo)均通過實驗直接求得。在各指標(biāo)測定方法的選擇上，若ISO或OECD已有標(biāo)準(zhǔn)化的測試方法，則優(yōu)先采用。若目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法，則采用文獻(xiàn)方法。通過比較，本研究中各微生物指標(biāo)采用的測定方法如下：土壤微生物量碳采用ISO 14240: 1997中規(guī)定的熏蒸法[14]；土壤呼吸強度根據(jù)ISO 16072: 2002進(jìn)行測定[16]；土壤硝化作用采用ISO 14238: 1997的方法[13]；土壤脫氫酶活性采用ISO 23753: 2005中的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)比色法測定[17]；脲酶活性用苯酚鈉比色法測定[22]；微生物群落功能多樣性采用碳素利用法(Biolog)測定，所用Biolog微平板為含31種碳源的Biolog Eco板[23]。

1.4 測試時間

土壤微生物量碳、呼吸強度、脫氫酶活性和脲酶活性分別在PCBs處理后的第14和28天進(jìn)行測試。硝化作用的測定根據(jù)ISO 14238: 1997的規(guī)定在PCBs和(NH4)2SO4處理后的第28天進(jìn)行。Biolog測試在PCBs處理后的第28天進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)首先采用數(shù)據(jù)處理軟件DPS9.50進(jìn)行異常值剔除，再采用SPSS17.0進(jìn)行差異顯著性分析。EC10值通過利用Origin 8.0自帶的Dose-Response方程對PCBs與微生物指標(biāo)間的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行擬合后求得，方程的表達(dá)式為：y=A1+(A2-A1)/[1+10(Logx(-x)p]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PCBs對土壤微生物量碳的影響

由圖1可知，在2種土壤中，不同濃度的PCBs處理下土壤微生物量碳含量與對照相比均無顯著性差異?？梢哉J(rèn)為，在培養(yǎng)期間內(nèi)PCBs對土壤微生物量碳的影響不明顯。因此，微生物量碳不宜作為PCBs短期污染土壤的生態(tài)毒理評價指標(biāo)。

2.2 PCBs對土壤呼吸強度及代謝熵的影響

由圖2可知，外源PCBs對土壤呼吸強度具有促進(jìn)作用，2種土壤的呼吸強度均隨PCBs濃度的增加而增強。在紅壤中，14 d時，5、10和50 mg·kg-1PCBs處理下呼吸強度與對照之間具有顯著性差異，28 d時，1、5、10和50 mg·kg-1PCBs處理下呼吸強度顯著增強。潮土中，14 d時，僅0.25 mg·kg-1PCBs處理組與對照之間差異不顯著，28 d時，5、10和50 mg·kg-1PCBs處理組的呼吸強度與對照之間差異顯著。紅壤和潮土14 d時呼吸強度的最大增長率分別為32%和14%，28 d時分別為50%和19%。

通過計算呼吸強度與微生物量碳的比值可以得到土壤的代謝熵，結(jié)果如圖3。PCBs對土壤代謝熵也有一定的促進(jìn)作用。在紅壤中，14 d時，僅50 mg·kg-1PCBs處理組與對照之間差異顯著，28 d時，5、10和50 mg·kg-1PCBs處理組與對照之間差異顯著。潮土中的情況與紅壤中的相反，14 d時，5、10和50 mg·kg-1PCBs處理組與對照之間差異顯著，而28 d時僅50 mg·kg-1PCBs處理組與對照之間差異顯著。紅壤和潮土14 d時代謝熵的最大增加率分別為39%和1%，28 d時分別為39%和9%。

表2 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of the studied soils

注：pH值測定時土液比為1: 2.5 Note: The ratio of water to soil is 1: 2.5.

圖1 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤微生物量碳的影響注：* 與對照相比，p<0.05，下同。Fig. 1 Effects of polychlorinated biphenyls (PCBs) on soil microbial biomass carbonNote: * p<0.05, compared with the control, the same below.

圖2 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤呼吸強度的影響Fig. 2 Effects of PCBs on soil respiration

圖3 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤代謝熵的影響Fig. 3 Effects of PCBs on soil metabolic quotient

2.3 PCBs對土壤硝化作用的影響

從圖4可以看出，在紅壤中，當(dāng)PCBs濃度≥ 1 mg·kg-1時，硝化作用受到顯著抑制，抑制率分別為26%、23%、23%和36%。而在潮土中，所有PCBs處理組的硝化作用均受到抑制，且與對照之間差異顯著，各處理硝化作用抑制率分別為16%、15%、11%、13%、18%和23%。

2.4 PCBs對土壤酶活性的影響

2.4.1 脲酶

從圖5可以看出，2種土壤中各PCBs處理下的脲酶活性與對照之間均無顯著性差異，這說明外源PCBs對脲酶活性影響不大，在14 d和28 d時脲酶活性不宜作為指示土壤PCBs污染的生態(tài)毒理指標(biāo)。

2.4.2 脫氫酶

由圖6可以看出，外源PCBs對紅壤和潮土的脫氫酶活性產(chǎn)生了截然不同的2種效應(yīng)。在紅壤中，PCBs對脫氫酶活性產(chǎn)生了抑制作用。14 d時，當(dāng)PCBs濃度≥ 5 mg·kg-1時，脫氫酶活性隨PCBs濃度的增加而顯著降低，降低幅度最大達(dá)到30%；28 d時，當(dāng)PCBs濃度≥ 1 mg·kg-1時，脫氫酶活性隨PCBs濃度增加而顯著降低，最大降低幅度率約為35%。潮土中，10和50 mg·kg-1PCBs處理的土壤脫氫酶活性與對照相比顯著增強；14 d和28 d脫氫酶的最大增加率分別為27%和35%。

2.5 PCBs對土壤微生物功能多樣性的影響

從表3可知，紅壤中PCBs處理對Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)影響不顯著，對McIntosh指數(shù)有顯著影響，各PCBs處理下McIntosh指數(shù)與對照相比均顯著增加，但未表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。在潮土中，僅50 mg·kg-1PCBs處理組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與對照相比顯著增加，其余處理組的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)與對照之間均無顯著性差異。以上結(jié)果說明PCBs處理對土壤微生物功能多樣性有一定的促進(jìn)作用，但劑量-效應(yīng)關(guān)系不明顯，因而功能多樣性不宜作為PCBs污染土壤的生態(tài)毒理指標(biāo)。

圖4 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤硝化作用的影響Fig. 4 Effects of PCBs on soil nitrification

圖5 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤脲酶活性的影響Fig. 5 Effects of PCBs on soil urease activity

圖6 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤脫氫酶活性的影響Fig. 6 Effects of PCBs on soil dehydrogenase activity

表3 多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤微生物多樣性的影響Table 3 Effects of PCBs on soil microbial diversity

注：* 與對照相比，p<0.05。 Note: * p<0.05, compared with the control.

2.6 多氯聯(lián)苯(PCBs)與土壤微生物指標(biāo)間的劑量-效應(yīng)關(guān)系

利用Dose-Response方程對具有明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系的微生物指標(biāo)進(jìn)行擬合，求解出EC10值，結(jié)果如表4所示。根據(jù)EC10值的大小對各指標(biāo)的敏感性進(jìn)行排序，紅壤中各指標(biāo)的敏感性順序為：代謝熵>脫氫酶活性>呼吸強度(14 d)，呼吸強度>代謝熵>脫氫酶活性>硝化作用(28 d)。潮土中的順序為：呼吸強度>脫氫酶活性>代謝熵(14 d)，脫氫酶活性>呼吸強度>硝化作用>代謝熵(28 d)。同時，EC10值還可以表示PCBs對土壤微生物各指標(biāo)毒性的大小，即EC10值越小則毒性越大。在2種土壤中，28 d時PCBs對脫氫酶活性、呼吸強度和代謝熵的EC10值均小于相應(yīng)的14 d時的EC10值，說明28 d時PCBs對土壤微生物的毒性作用大于14 d。此外，紅壤的EC10值均小于潮土，這說明了PCBs在紅壤中的毒性作用更強。

表4 PCBs對土壤微生物指標(biāo)的EC10值Table 4 EC10 values of PCBs for the soil microbial indicators

注：括號內(nèi)數(shù)字表示擬合方程的R2值，EC10單位為mg·kg-1。

Note: number in brackets denote the R2of the linear regression equation, EC10value is expressed in mg·kg-1.

3 討論(Discussion)

3.1 不同微生物指標(biāo)對PCBs的敏感性差異及敏感指標(biāo)篩選

在紅壤和潮土中，微生物量碳、脲酶活性和微生物功能多樣性對外源PCBs反應(yīng)不夠敏感，且與外源PCBs濃度之間無明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。對于土壤微生物量碳，高軍等[24]在PCBs自然污染的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)微生物量碳隨污染程度的加劇呈下降趨勢。Anan’eva等[5]研究了PCBs對灰色森林土壤0～20 cm層中土壤微生物量碳的影響，發(fā)現(xiàn)在第14天和29天時，2 mg·kg-1PCBs處理的微生物量碳與對照相比顯著降低，但20 mg·kg-1PCBs處理與對照間卻無顯著差異。而本研究發(fā)現(xiàn)外源PCBs對土壤微生物量碳無顯著影響，這與前人的研究結(jié)果有差異，可能與土壤類型、土壤性質(zhì)、PCBs單體組成、污染時間以及微生物區(qū)系等因素原因有關(guān)。

對于脲酶，有假設(shè)認(rèn)為其作為胞外酶可以與土壤粘粒和腐殖質(zhì)膠體結(jié)合而形成粘粒-酶或腐殖質(zhì)-酶的復(fù)合體，從而酶的活性可以得到有效的保護(hù)[25-27]。這或許是本研究中脲酶活性對PCBs污染不敏感的一個可能原因。

對于微生物多樣性，理論上，若土壤中敏感的微生物物種被生理生化強度(例如，呼吸強度和硝化作用)相當(dāng)?shù)目剐晕锓N取代后，土壤的生理生化強度指標(biāo)并未改變，而生物多樣性卻會發(fā)生改變。因此，土壤微生物多樣性理論上要比微生物生理生化強度更為敏感[28]。本研究采用了被廣泛應(yīng)用的Biolog方法指示土壤微生物功能多樣性，結(jié)果表明土壤微生物多樣性對PCBs污染反應(yīng)并不敏感。這可能是由于Biolog方法存在一定的缺陷，即難以精確測定微生物多樣性，并且可能低估微生物的種間差異[29]。目前，測定微生物多樣性的方法和技術(shù)還不是很成熟，有各自的優(yōu)缺點及適用性，單一的測定方法可能無法全面準(zhǔn)確地測定土壤微生物多樣性狀況[30]。未來可嘗試其他微生物多樣性的測定方法，如磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)法[30]、變性梯度凝膠電泳法(PCR-DGGE)[30]等進(jìn)行研究。

相比之下，土壤呼吸強度、代謝熵、硝化作用和脫氫酶活性對PCBs污染反應(yīng)較為敏感，并且與PCBs之間具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。呼吸強度是指土壤微生物活動中釋放CO2的速率，可以用來衡量土壤微生物的總活性，也可代表土壤代謝的旺盛程度[31]。當(dāng)污染物進(jìn)入土壤，會對土壤微生物群落造成擾動，敏感物種將被抗性物種替代[4]，這樣原有的代謝強度也將會被新的代謝強度替代。因此，理論上，呼吸強度可以作為指示土壤PCBs污染的敏感指標(biāo)。孫紅斌等[7]和Anan’eva等[5]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)土壤呼吸強度對PCBs污染反應(yīng)敏感。此外，經(jīng)典的密閉堿液吸收法和氣相色譜法可以較為精確地測定CO2濃度，因此將土壤呼吸強度作為PCBs污染土壤的生態(tài)毒理指標(biāo)從理論和實踐上都是可行的。

對于代謝熵，有研究認(rèn)為代謝熵增強是微生物群落應(yīng)對不良外界環(huán)境的表現(xiàn)[32]。例如，吳宇澄等[33]和Anan’eva等[5]均在研究中發(fā)現(xiàn)了PCBs對代謝熵有顯著促進(jìn)作用。代謝熵是通過計算呼吸強度與微生物量碳的比值而得出，本研究中微生物量碳對PCBs反應(yīng)不敏感，而呼吸強度的敏感性僅在紅壤14 d時低于代謝熵(表4)，若以呼吸強度代替代謝熵作為敏感指標(biāo)不僅可以保持對外源PCBs較強的敏感性，還可以省去微生物量碳的測定。因此，從經(jīng)濟實用的角度考慮，在PCBs污染土壤生態(tài)毒理實驗中可以不考慮將代謝熵作為首選敏感指標(biāo)。

硝化作用因其對土壤重金屬污染的敏感性以及在氮循環(huán)中的重要作用，在指示土壤污染對微生物活性影響時具有廣泛的應(yīng)用[34]。目前，有機污染物對硝化作用的影響已有一些報道。Du?ek等[35]的研究結(jié)果表明，長期污染土壤中PCBs對硝化作用有顯著抑制作用。Maliszewska-Kordybach等[36]發(fā)現(xiàn)土壤菲污染與硝化作用之間有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。此外，ISO制定的檢測土壤硝化作用的方法操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定，再綜合本研究的結(jié)果，可以認(rèn)為硝化作用在指示土壤PCBs污染方面是一個非常有潛力的指標(biāo)。

脫氫酶是一種細(xì)胞內(nèi)酶，其活性往往與活體細(xì)胞的活性有關(guān)。它一方面反映了土壤微生物的生存狀況，另一方面也反映了土壤生理-化學(xué)狀況，因此常被用來指示土壤污染[37]。姚超英[38]和逄煥成等[39]的研究結(jié)果表明，土壤脫氫酶活性對DDT(雙對氯苯基三氯乙烷)和PCBs等有機污染物的毒性效應(yīng)有很好的指示作用。本文中PCBs與紅壤和潮土脫氫酶活性之間均有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并且脫氫酶活性的測定已有標(biāo)準(zhǔn)方法，操作簡單，無需昂貴、復(fù)雜的設(shè)備，因此土壤脫氫酶在指示土壤PCBs污染方面是一個比較好的指標(biāo)。

綜上所述，建議在以后的PCBs污染土壤的生態(tài)毒理研究中優(yōu)先選取呼吸強度、硝化作用和脫氫酶活性作為敏感指標(biāo)。

3.2 影響多氯聯(lián)苯(PCBs)對土壤微生物毒理效應(yīng)的因素

首先，PCBs同族體的數(shù)目繁多，結(jié)構(gòu)類似，但是結(jié)構(gòu)上微小的差別卻能造成它們環(huán)境行為的巨大差異，聯(lián)苯分子上氯代程度和位置的不同，PCBs同族體的物理、化學(xué)、生物和毒理學(xué)的性質(zhì)也可能會不同[40]。因此，衡量土壤PCBs污染的生態(tài)風(fēng)險，最首要的是選取合適的PCBs混合物進(jìn)行生態(tài)毒理實驗。目前PCBs污染土壤生態(tài)毒理研究中使用最多的有2種：工業(yè)PCBs標(biāo)準(zhǔn)品Aroclor系列和單體PCBs混合物。Aroclor系列組分復(fù)雜，僅給出PCBs含氯的百分比，并且不同流水線的產(chǎn)品其單體組成及空間結(jié)構(gòu)可能不相同。因此，進(jìn)行PCBs污染土壤的生態(tài)毒理實驗時，Aroclor系列標(biāo)準(zhǔn)品不是最理想的選擇。本文選擇的7種PCBs單體在我國長江三角洲、珠江三角洲等PCBs污染地區(qū)的農(nóng)田土壤中都有很高的含量[41-42]。因此，以這7種單體為指示性PCBs進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究具有重要現(xiàn)實意義。

其次，土壤性質(zhì)是影響PCBs對土壤微生物毒性效應(yīng)的重要因素。其中，土壤有機質(zhì)可以通過吸附作用使有機污染物的生物有效性降低從而降低其生態(tài)毒性[43]。本研究中，潮土有機質(zhì)含量遠(yuǎn)高于紅壤，這可能是導(dǎo)致潮土中PCBs的毒性作用低于紅壤的一個重要的原因。有研究表明，在微生物數(shù)量多、種類豐富的土壤中，土壤生態(tài)系統(tǒng)的抗逆性更強[44-45]。潮土中微生物量碳、生理生化強度、酶活性和微生物多樣性都明顯高于紅壤，表明潮土微生物數(shù)量更大、種類更多、活性更強，這可能是潮土中PCBs的毒性作用低于紅壤的又一個重要原因。值得注意的是，脫氫酶活性在紅壤中受到抑制，而在潮土中受到促進(jìn)，這也可能是受到土壤性質(zhì)的影響，因為每種土壤都有其特定的微生物群落因而對污染物也可能具有不同的反應(yīng)模式[4]。

此外，培養(yǎng)時間是影響PCBs對土壤微生物毒性效應(yīng)的又一重要因素。在紅壤和潮土中，28 d時PCBs對土壤微生物的毒性作用均大于14 d。這表明在28 d的培養(yǎng)期內(nèi)，PCBs對土壤微生物的生態(tài)毒性隨時間延長而增強。PCBs在土壤中自然降解非常困難，PCBs生物降解最開始也是最重要的一步就是還原脫氯，但當(dāng)PCBs達(dá)到一定濃度時，脫氯反應(yīng)才可持續(xù)進(jìn)行[46]。并且在一些土壤中，培養(yǎng)24周也未發(fā)現(xiàn)有脫氯反應(yīng)發(fā)生[47]。因此，可以認(rèn)為在本研究設(shè)定的濃度范圍和培養(yǎng)時間內(nèi)，PCBs未被微生物降解，其毒性作用仍然保持，隨時間的延長毒性作用增強。有研究表明培養(yǎng)時間過長，土壤微生物會因產(chǎn)生抗性而降低敏感性，在微生物生態(tài)毒理研究中不宜采取長期培養(yǎng)[4]。然而，培養(yǎng)時間過短，污染物對土壤微生物的毒性效應(yīng)就不能全面體現(xiàn)。ISO 14238、OECD 216、OECD 217等標(biāo)準(zhǔn)中將污染物的培養(yǎng)時間設(shè)為28 d，從本研究的結(jié)果來看，這個培養(yǎng)時間的設(shè)置是合理的。因此，建議以后的PCBs污染土壤的生態(tài)毒理研究中采用28 d為培養(yǎng)時間。

綜上所述，PCBs對土壤微生物的毒性作用存在時間效應(yīng)并受土壤性質(zhì)的影響，建議將培養(yǎng)時間設(shè)置為28 d。微生物量碳，脲酶活性和微生物功能多樣性不宜作為PCBs短期污染土壤的生態(tài)毒理指標(biāo)。土壤呼吸強度、代謝熵、硝化作用和脫氫酶活性對PCBs污染反應(yīng)較為敏感，從經(jīng)濟實用的角度，建議將呼吸強度、硝化作用和脫氫酶活性作為PCBs污染土壤生態(tài)毒理研究中的首選敏感指標(biāo)。

致謝：宋靜(1974 —)，男，博士，副研究員，主要研究方向為污染土壤的風(fēng)險評估和環(huán)境基準(zhǔn)。

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◆

EcotoxicityofPolychlorinatedBiphenyls(PCBs)toMicroorganismsinChineseUdic-ferrosolsandAquic-cambosols

Cheng Jinjin1,2, Song Jing1,2,*, Lv Mingchao1,2, Wang Xingxiang1,2

1. Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

17 September 2013accepted18 November 2013

Polychlorinated biphenyls (PCBs), as persistent organic pollutants (POPs), will persist in the soil and exert potential harm to the soil biota once they enter the soil environment. Soil microorganisms are important constituents of soil ecosystem. Therefore, it is necessary to investigate the ecotoxicological effects of PCBs on different indicators of soil microorganisms, screen sensitive microbial indicators and accumulate reliable experimental data. In the present study, a microbial ecotoxicity test was conducted on an udic-ferrosols from Jiangxi and an aquic-cambosols from Tianjin at 25 ℃ for 28 days. And soil microbial biomass carbon, respiration, metabolic quotient, nitrification, dehydrogenase activity, urease activity and microbial functional diversity were chosen as microbial indicators. The results showed that the ecotoxic effect of PCBs on soil microbial indicators at day 28 was greater than that at day 14 in both soils. The microbial activity was less inhibited in the aquic-cambosols than that in the udic-ferrosols, which indicated that the ecotoxic effect of PCBs was influenced by incubation time and soil properties. The microbial indicators were different in their sensitivities to PCBs. It was found that soil microbial biomass carbon, urease activity and microbial functional diversity were not sensitive to PCBs pollution, while soil respiration, metabolic quotient, nitrification and dehydrogenase activity were sensitive to PCBs pollution. At day 14, the EC10values of PCBs for dehydrogenase activity, respiration and metabolic quotient were 1.20, 3.18 and 1.09 mg·kg-1in udic-ferrosols and were 6.31, 4.73 and > 50 mg·kg-1in aquic-cambosols. At day 28, the EC10values of PCBs for nitrification, dehydrogenase activity, respiration and metabolic quotient were 2.32, 0.77, 0.51 and 0.71 mg·kg-1in udic-ferrosols and were 5.91, 1.65, 3.00 and > 50 mg·kg-1in aquic-cambosols. For economic and practical reasons, soil respiration, nitrification and dehydrogenase activity and 28-day incubation time were recommended for future microbial ecotoxicity test of PCBs pollution.

polychlorinated biphenyls (PCBs); udic-ferrosols; aquic-cambosols; soil microorganism; ecotoxicity

環(huán)保公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201009032)；國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2009AA063104)

程金金(1987-)，女，博士，研究方向為污染物的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)，E-mail: jjcheng@issas.ac.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: jingsong@issas.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130917002

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2013-09-17錄用日期2013-11-18

1673-5897(2014)2-273-11

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