MBR-CANON工藝處理生活污水的快速啟動(dòng)及群落變化

張肖靜，李 冬，梁瑜海，張玉龍，何永平，范 丹，張 杰

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱;2.北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100124北京)

近年來發(fā)展起來的厭氧工藝將越來越多的廢水有機(jī)碳源轉(zhuǎn)化為生物能源利用，導(dǎo)致傳統(tǒng)脫氮工藝硝化反硝化所需碳源不足，進(jìn)而限制了脫氮效率［1］.而全程自養(yǎng)脫氮工藝(completely nitrogen removal over nitrite，CANON)可以利用氨氧化細(xì)菌(AOB)和厭氧氨氧化菌(anammox)的協(xié)同作用，在不消耗有機(jī)碳源的條件下實(shí)現(xiàn)脫氮，同時(shí)節(jié)省63%的曝氣量，被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效的脫氮途徑，目前已成功應(yīng)用于一些生物膜系統(tǒng)中［2-3］.在這些系統(tǒng)中，AOB處于生物膜外層消耗 DO，anammox處于缺氧內(nèi)層去除氨氮和亞氮，然而生物膜法存在的堵塞等問題限制了該工藝的進(jìn)一步發(fā)展.因此，關(guān)于活性污泥法CANON工藝的研究十分必要.目前活性污泥法的研究一般集中在SBR工藝［4-5］以及近幾年新興的膜曝氣反應(yīng)器［6-7］.由于自養(yǎng)菌AOB及 anammox生長緩慢，導(dǎo)致CANON工藝的啟動(dòng)周期長，去除負(fù)荷低，解決這些問題的關(guān)鍵是污泥的截留.MBR反應(yīng)器可以將所有微生物截留在反應(yīng)器內(nèi)，達(dá)到較高的生物濃度，使反應(yīng)器的去除負(fù)荷得到提高，同時(shí)具有較好的出水水質(zhì).有研究表明，MBR可以有效富集以游離或者聚集體形式存在的AOB和anammox等自養(yǎng)菌［8］，因此，若將MBR應(yīng)用于CANON工藝的研究，一方面可以解決該工藝負(fù)荷低等問題，另一方面將推進(jìn)MBR在污水處理領(lǐng)域的應(yīng)用，目前關(guān)于 MBR-CANON工藝的研究未見報(bào)道，此外，CANON工藝的研究大多是基于高氨氮或者高溫廢水進(jìn)行的，常溫生活污水的研究較少，為此，提出采用MBR反應(yīng)器研究生活污水CANON工藝.

本實(shí)驗(yàn)考察了常溫下低氨氮CANON工藝的快速啟動(dòng)策略，以及該工藝應(yīng)用于實(shí)際生活污水處理的可行性.同時(shí)，利用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)分析了不同運(yùn)行階段反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)特征.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 反應(yīng)器設(shè)置

采用有機(jī)玻璃圓柱形MBR反應(yīng)器(圖1).反應(yīng)器高20cm，內(nèi)徑20cm，有效體積5.5L.內(nèi)部放置聚偏氟乙烯中空纖維膜組件(廈門，鯤揚(yáng))，膜孔徑0.1 μm，有效面積0.2 m2.底部設(shè)曝氣環(huán)供氧，并設(shè)攪拌器混合泥水.整個(gè)反應(yīng)器置于直徑為30 cm的水浴中，保證恒溫25℃運(yùn)行.

圖1 MBR反應(yīng)器裝置

1.2 接種污泥及廢水

接種污泥取自以A2/O工藝運(yùn)行的北京高碑店污水處理廠的普通活性污泥(12.9 g/L，2 L).實(shí)驗(yàn)前期采用人工配水(NH4+-N為80 mg/L左右，接近擬處理的生活污水質(zhì)量濃度)，后期處理某大學(xué)生活區(qū)污水.配水以(NH4)2SO4和NaHCO3為主要基質(zhì)，并添加 KH2PO4(0.068 g/L)、MgSO4·H2O(0.15 g/L)、CaCl2(0.068 g/L)及微量元素(1 mL/L).實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行240 d，包括亞硝化的啟動(dòng)、CANON工藝的啟動(dòng)及穩(wěn)定運(yùn)行、處理生活污水3個(gè)階段.實(shí)驗(yàn)期間污泥齡為100 d，反應(yīng)溫度25℃，其他運(yùn)行參數(shù)及各階段水質(zhì)指標(biāo)見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)期間水質(zhì)指標(biāo)及反應(yīng)器運(yùn)行參數(shù)

1.3 分析方法

NH4+-N:納氏試劑分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:紫外分光光度法;COD:5B-3B型COD測(cè)定儀;堿度:ZDJ-2D電位滴定儀;DO、pH、T:WTW多電極測(cè)定儀.

1.4 變性梯度凝膠電泳—克隆—測(cè)序

從不同階段的反應(yīng)器中取混合液離心后收集沉淀，取 1.5 g沉淀加入 10 ml磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH8.0)清洗2次.按文獻(xiàn)［9］方法進(jìn)行總DNA提取，電泳檢驗(yàn)后用試劑盒(上海生工)對(duì)DNA純化回收，以回收的DNA為模板進(jìn)行PCR.采用通用引物 BSF338-GC(5’-(下劃線部分為“GC”夾)和BSR518(ATTACCGCGGCGCTGG)對(duì)全細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增［10］.反應(yīng)體系組成為:DNA 1.0 μL，10 × Buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL，正義引物和反義引物(10 μmol/L)各1 μL，Ex Taq 酶(5 U/μL)0.125 μL，補(bǔ)水至終體積為25 μL.PCR擴(kuò)增條件為:94℃，5 min;94℃，40 s，55 ℃，40 s，72 ℃，1 min，35 個(gè)循環(huán);72℃，10 min.在 D-Code System(Bio-Rad)內(nèi)利用DGGE對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，電泳條件:聚丙烯酰胺8%，變性梯度30% ～60%，緩沖液為1×TAE，電壓120 V，溫度60℃，時(shí)間5 h.之后將凝膠進(jìn)行銀染［11］，將凝膠上條帶切下溶于200 μL 1×TE中，4℃放置過夜.以此為模板再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增.將純化回收的PCR產(chǎn)物連接到載體pMD19-T(TaKaRa)上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α(TaKaRa)中克隆.陽性克隆送交上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列通過BLAST進(jìn)行比對(duì)，并提交至Gentbank.

2 結(jié)果與討論

2.1 MBR亞硝化的啟動(dòng)及穩(wěn)定運(yùn)行

亞氮的積累是實(shí)現(xiàn)CANON工藝的關(guān)鍵步驟，這需要在富集AOB的同時(shí)抑制NOB的活性.本階段控制進(jìn)水氨氮為80 mg/L左右，堿度為640 mg/L左右，曝氣量為 0.3 L/min，DO為0.2 mg/L左右，采用逐漸減小HRT(8～3.5 h)的策略抑制NOB，MBR的運(yùn)行情況如圖2所示.亞氮在最初2 d短暫積累后迅速降至0，所有的氨氮均被轉(zhuǎn)化為硝氮，之后隨著HRT的降低，氨氧化率逐漸下降，出水氨氮增多，然而出水亞氮仍然為0，說明NOB的活性沒有受到抑制.直至第25天當(dāng)HRT降為3.5 h時(shí)，亞氮開始積累，亞氮積累率(RNA)在一周之內(nèi)迅速上升至60%以上，此時(shí)，氨氮去除率為50%左右，認(rèn)為成功實(shí)現(xiàn)了AOB的富集及亞硝化啟動(dòng).然而，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，RNA難以進(jìn)一步提高，說明此時(shí)NOB的活性依然沒有被完全抑制.為了進(jìn)一步提高RNA，繼續(xù)降低HRT為2.4 h，亞氮積累率又迅速上升，最終達(dá)99%以上，并保持穩(wěn)定運(yùn)行20 d，之后進(jìn)行CANON工藝的啟動(dòng).

減小HRT的本質(zhì)是縮短反應(yīng)時(shí)間，使NOB沒有足夠的時(shí)間消耗亞氮，最終實(shí)現(xiàn)亞氮的積累.同時(shí)，反應(yīng)時(shí)間的減少也導(dǎo)致大量氨氮?dú)埩粼诜磻?yīng)器中，形成較高的游離氨(FA)質(zhì)量濃度，在第天亞氮開始積累時(shí)，反應(yīng)器內(nèi)氨氮濃度為50 mg/L左右，F(xiàn)A質(zhì)量濃度為2.6 mg/L，能夠有效抑制NOB的活性.同時(shí)，反應(yīng)器內(nèi)DO較低，一直維持在0.2 mg/L左右，也有利于氧飽和常數(shù)較低的AOB生長.隨著AOB活性的增強(qiáng)及數(shù)量的增多，氨氧化率在亞氮積累后也逐漸回升，最終穩(wěn)定在70%左右，這說明HRT的降低并沒有限制AOB的活性，最終出水氨氮降為20 mg/L以下.該階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)HRT在限氧條件下可以快速啟動(dòng)亞硝化，該方法簡單易實(shí)施，無需改變進(jìn)水水質(zhì)、升溫或者外部投加藥物等.

圖2 MBR亞硝化的快速啟動(dòng)

2.2 MBR-CANON工藝的啟動(dòng)及穩(wěn)定運(yùn)行

本階段的主要目的是誘導(dǎo)anammox的活性，實(shí)現(xiàn)CANON工藝.在亞硝化啟動(dòng)成功并穩(wěn)定運(yùn)行后，保持其他參數(shù)不變，將曝氣量由0.3 L/min降為0.2 L/min，此時(shí)反應(yīng)器內(nèi)DO降為0.2 mg/L，而污泥絮體形成的氧梯度可以使內(nèi)部的DO降到更低，因而有利于anammox的生存.同時(shí)進(jìn)一步降低HRT為1.9 h，提高進(jìn)水氨氮負(fù)荷，使得單位氨氮的氧分壓減少，也有利于CANON工藝的實(shí)現(xiàn)［7］.由圖3可知，在降低曝氣量后反應(yīng)器內(nèi)逐漸出現(xiàn)了 TN去除的現(xiàn)象，第 78天RNR達(dá)0.1 kg/(m3·d)，CANON 工藝啟動(dòng)成功.之后RNR逐漸升高，但升高速度緩慢，且反應(yīng)器內(nèi)有較多的氨氮?dú)埩?原因是AOB活性較低，不能將所有的氨氮轉(zhuǎn)化為亞氮，因此，為了提高氨氮去除率，在第123天加大曝氣量為0.3 L/min，RNR迅速升高，最終穩(wěn)定在0.70 kg/(m3·d)左右.這說明之前的供氧不足限制了CANON的活性，適當(dāng)加大曝氣量有利于TN的去除.之后發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器中同時(shí)有氨氮與亞氮?dú)埩簦蚴莂nammox的活性不足，不能將氨氮和亞氮完全轉(zhuǎn)化為氮?dú)?有研究認(rèn)為提高無機(jī)碳源質(zhì)量濃度有利于提高anammox的活性［12］.因此，在進(jìn)水中增加了NaHCO3的質(zhì)量濃度，使無機(jī)碳源質(zhì)量濃度達(dá)200 mg/L左右，pH由7.58升高到7.86，結(jié)果RNR第二次迅速上升，最終穩(wěn)定在0.95 kg/(m3·d)左右.

圖3 MBR-CANON工藝的啟動(dòng)及高效運(yùn)行

CANON的啟動(dòng)歸因于以下幾個(gè)方面:MBR中膜的截留能力可將微生物截留在反應(yīng)器內(nèi)，適宜SRT較長的微生物如AOB和anammox生長，避免了功能菌的流失;膜的抽吸作用使一些污泥吸附在膜絲表面，形成局部缺氧微環(huán)境，為anammox的增殖創(chuàng)造了適宜條件;反應(yīng)器內(nèi)較低的DO和較高的氨氮負(fù)荷有利于AOB和anammox的生存.本階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明曝氣不足會(huì)抑制CANON的脫氮效果，但較高的曝氣不利于CANON的穩(wěn)定，可能造成亞氮積累或者誘導(dǎo)NOB的活性，因此，應(yīng)維持適宜的曝氣量及DO.此外，較高的無機(jī)碳源有利于強(qiáng)化anammox的活性，提高總氮去除負(fù)荷.目前已報(bào)道的活性污泥法CANON工藝的啟動(dòng)時(shí)間均需幾百天以上，去除負(fù)荷在 0.06 ～ 0.8 kg/(m3·d)［13］，而且大多接種的為不易獲得的厭氧氨氧化污泥.而本實(shí)驗(yàn)接種普通活性污泥在78 d內(nèi)成功啟動(dòng)了CANON工藝，并且具有較高的總氮去除負(fù)荷(0.95 kg/(m3·d))和去除率(81%)，具有較明顯的優(yōu)勢(shì).

2.3 MBR-CANON工藝處理生活污水的運(yùn)行效果

從第179天起將MBR用于處理生活污水，考慮到生活污水中存在300 mg/L左右的COD，將曝氣量增加為0.4 L/min，處理效果見圖4.引入生活污水第1天，RNR即降至0.63 kg/(m3·d).研究表明，有機(jī)物的增加將抑制anammox的活性，同時(shí)，生活污水中含有的固體懸浮顆粒(SS)及表面活性劑等物質(zhì)均不利于微生物的生存.初始COD去除率為20%，之后逐漸上升，最終穩(wěn)定在80%左右，這可能是由于生活污水中存在一部分異養(yǎng)菌，在好氧條件下其活性逐漸增強(qiáng)，將COD氧化，出水COD降到100 mg/L以下.反應(yīng)器內(nèi)COD的降低消除了其對(duì)anammox的抑制，RNR的下降速率逐漸減緩，在第192天開始回升，最終穩(wěn)定在0.97 kg/(m3·d)以上.可見本實(shí)驗(yàn)COD對(duì)微生物的抑制是暫時(shí)且可逆的，而且該工藝處理生活污水的TN去除比配水時(shí)略高，原因是生活污水中存在的COD使反應(yīng)器內(nèi)發(fā)生了一部分反硝化或者短程反硝化反應(yīng)，AOB、anammox、異養(yǎng)菌以及反硝化菌在MBR內(nèi)協(xié)同作用，共同完成了TN和COD的高效去除.

圖4 生活污水中污染物的去除效果

值得注意的是，MBR能夠有效截留SS.本階段由于天氣、人為、生活規(guī)律等影響，進(jìn)水濁度波動(dòng)較大，但是出水濁度均保持在1 NTU以下，達(dá)到了回用水標(biāo)準(zhǔn).目前城市污水廠采用的傳統(tǒng)硝化-反硝化脫氮工藝，消耗較多的曝氣量及外加碳源，同時(shí)出水需要二沉池靜沉及進(jìn)一步的深度處理.本研究采用MBR-CANON系統(tǒng)處理生活污水，節(jié)省63%的曝氣量，同時(shí)無需外加碳源，在單一反應(yīng)器內(nèi)實(shí)現(xiàn)了總氮和COD的同時(shí)高效去除，無需二沉池即可得到較好的出水水質(zhì)，出水可直接用于校園草坪及花圃的澆灌等，為含氮廢水的處理及回用提供了新思路.

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)特征

圖5為DGGE圖譜結(jié)果，4個(gè)樣品從左至右依次為接種污泥、反應(yīng)器運(yùn)行第60天、第170天及第235天的泥樣，測(cè)序及BLAST比對(duì)結(jié)果見表2.接種污泥中，β-變形菌綱(β-Proteobacteria)、γ變形菌綱(γ-Proteobacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetia)以及酸桿菌門(Acidobacteria)的微生物為占優(yōu)勢(shì)地位的菌群，此外還存在梭菌綱(Clostridia)、桿菌綱(Bacilli)、α-變形菌綱(α-Proteobacteria)的微生物．然而，以無機(jī)配水運(yùn)行60 d后，條帶數(shù)由13個(gè)減少為6個(gè)，說明生物種類減少，最終在實(shí)現(xiàn)CANON工藝后，脫氮菌成為反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌群.

圖5 不同階段的反應(yīng)器內(nèi)微生物DGGE結(jié)果

條帶7、12與 AOB中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)相似度高達(dá)97%和99%，在種泥與反應(yīng)器運(yùn)行的3個(gè)階段均存在，這說明反應(yīng)器的運(yùn)行條件有利于該種微生物的生存，AOB逐漸成為反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌群.條帶9與AOB中的Nitrosococcus mobilis相似度高達(dá)99%，只存在于第I、II階段，說明城市污水及生活污水中有機(jī)物的存在不利于該種微生物的生存.條帶6與浮霉菌綱(Planctomycetia)中的待定斯圖加特庫氏菌(Candidatus Kuenenia)相似度高達(dá)99%，Candidatus Kuenenia是一種典型的Anammox菌屬［16］，在反應(yīng)器運(yùn)行的第II階段才出現(xiàn)，與反應(yīng)器表現(xiàn)出自養(yǎng)脫氮能力的時(shí)間一致，證明反應(yīng)器內(nèi)氨氮的去除是由AOB和anammox菌共同作用完成的.值得注意的是，條帶13所代表的NOB中的Nitrobacter在4個(gè)樣品中均存在，這說明本實(shí)驗(yàn)中NOB只是活性受到了抑制，并沒有被完全淘洗出反應(yīng)器.污水處理系統(tǒng)中氨氧化細(xì)菌的多樣性程度越高，對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，抗沖擊能力就越強(qiáng)，該反應(yīng)器中存在兩種氨氧化菌和一種厭氧氨氧化菌，構(gòu)成了較為穩(wěn)定的脫氮系統(tǒng).

表2 序列比對(duì)結(jié)果

3 結(jié)論

1)在曝氣量為0.3 L/min的限氧條件下，保持進(jìn)水氨氮不變，通過減小HRT，在常溫MBR反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)32 d快速啟動(dòng)亞硝化.

2)亞硝化啟動(dòng)成功后，減小曝氣量為0.2 L/min，并進(jìn)一步降低HRT為1.9 h，經(jīng)78 d啟動(dòng)CANON工藝，并通過調(diào)節(jié)曝氣量及無機(jī)碳源質(zhì)量濃度，提高總氮去除負(fù)荷至0.95 kg/(m3·d).

3)將穩(wěn)定運(yùn)行的CANON工藝應(yīng)用于生活污水的處理，可以實(shí)現(xiàn)COD與氨氮的同時(shí)高效去除，TN去除負(fù)荷達(dá)0.97 kg/(m3·d)以上，COD去除率達(dá)80%以上，出水濁度小于1 NTU.

4)微生物群落在反應(yīng)器運(yùn)行的不同階段發(fā)生了較大變化，穩(wěn)定運(yùn)行的MBR-CANON反應(yīng)器中檢測(cè)到的氨氧化細(xì)菌為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，厭氧氨氧化菌與Candidatus Kuenenia stuttgariensis的相似度高達(dá)99%．

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