丸劑物料的不同配比組成對其體外溶出的影響研究＊

馬彥江，王 嬌，劉瑞霞，陳天朝,＊＊

（1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學 鄭州 450008；3.中牟縣中醫(yī)院 鄭州 451450）

丸劑指藥物與適宜的輔料，經適當的方式制成的球形或類球形固體制劑[1]，因其含有大量的淀粉、纖維、多糖等物質，具有不同的理化性質和輔料功能，因此是所謂的天然輔料[2]。中藥材就具有功能、藥輔合一的特點，但從目前研究和相關文獻報道看，影響制劑因素包括有效成分性質、粉料細度、泛丸速度、丸粒大小、干燥方法、包衣等[3]，對中藥物料既是藥效成分，又能影響制劑成型和釋放的研究卻鮮有報道[4,5]。李麗等人研究發(fā)現，中藥輔料有類似“骨架材料”、“微囊”、“微球”等作用[6]，能影響制劑釋放。程偉[7]等人，通過研究中藥對通脈丸士的寧和馬錢子堿體內外釋放的影響，發(fā)現纖維類與淀粉類物料對士的寧成分的溶出有促進作用，相反，油脂類與樹脂類對士的寧有抑制溶出的作用。陳天朝[8]等人，以總黃酮含量為考察指標，測定其溶出度，發(fā)現中藥纖維類的含量與水丸溶出度呈正相關。

中藥的藥物組成分與其他類型藥物相比較多，且制作工藝對組分的影響較大，因此本文提出溶出度的測定實驗對此進行考察。溶出度的測定對制劑處方及工藝條件的篩選有重要參考價值，避免研制工作中的盲目操作，清楚反映藥物在體內的吸收及藥效情況[9]。體外溶出對實驗的研究過程至關重要[10]，固體藥物制劑的體外溶出度數據是評價一種藥物制劑不同品種、不同批次間質量的重要數據[11]，故應運而生一種評價固體制劑內在品質的科學手段與方法，此類文獻中進行相關性的測試大多采用溶出曲線[12,13]。

根據前期課題組研究基礎，結合中藥丸劑實際生產需要及各類中藥臨床使用情況，從確定的7 類物料中優(yōu)選出纖維、淀粉、多糖、油脂、蛋白作為本次實驗所研究的物料類型，再根據各類物料中飲片含量及相關物料參數等數據，選擇纖維類升麻、淀粉類山藥、多糖類茯苓、油脂類火麻仁、蛋白類僵蠶作為本次模型丸劑物料飲片。通過調整中藥物料用量比例制備丸劑，利用HPLC 和紫外分光光度計測定其體外溶出度，研究中藥丸劑溶出過程，實現速釋或緩釋，達到控制藥效的目的，從而更好地提高中藥生物利用度[14]。

表1 各模型丸劑均勻設計處方比例

1 實驗儀器及材料

1.1 實驗儀器

真空干燥箱MG12（常熟市中藥制藥機械有限責任公司）；20B 萬能粉碎機（江陰市盛田機械制造有限公司）；Thermo Evolution 201 紫外可見光分光光度計（美國賽默飛）；ZRS-8C智能溶出試驗儀（天津大學無線電廠）；GP225D 電子天平（德國賽多利斯）；1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；18120純水裝置（上海摩勒科學儀器有限公司）；DL-I-15 高級臺式封閉電爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；AP-01P 抽濾泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；GZX-9070MBE 數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；HY-4調速多用振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；G100自動脂肪測定儀（上海晟聲儀器有限公司）；250 ml 回流裝置、量筒、玻璃坩堝等玻璃儀器由河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 實驗材料

黃連（批號：1801111）、升麻（批號：1804191）、山藥（批號：1804173）、僵蠶（批號：1801091）、火麻仁（批號：1803241）、茯苓（批號：18042544）均購置安徽普仁中藥飲片有限公司，飲片經河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定，符合2015 版《中華人民共和國藥典》（一部）飲片項下各項規(guī)定。

色譜乙腈（Sigma 試劑有限公司，H1208X45502）；磷酸（北京迪馬公司，色譜純）；鹽酸小檗堿（中國食品藥品檢定研究所，110713-201212-20 mg，純度≥98%）；甲醇（Sigma 試劑有限公司，色譜純），95%無水乙醇（Sigma試劑有限公司，20180910）；磷酸二氫鉀（天津市永大化學試劑有限公司，分析純）；十二烷基硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 鹽酸小檗堿色譜條件

①采用AgiLent SB-Aq（5 um，4.6 mm×250 mm）色譜柱；②流動相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（50：50），每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調節(jié)PH 值為4.0；③流速：1.0 mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長345 nm[14]。

2.1.2 紫外檢測條件

取鹽酸小檗堿對照品溶液，利用紫外分光光度計，以空白溶劑作對照，在200-700 nm 波長范圍內掃描,349 nm處有最大吸收,確定樣品測定波長為349 nm。

2.2 模型丸劑的制備

采用多因素多水平均勻設計法進行制劑的組方，把5種藥物看作影響丸劑溶出的五種物料因素。為便于研究需要，分別將5種藥材粉碎過80目篩，使用V型混合機混合粉末，混合時間設為30 min，處方量 500 g。泛制丸劑時糖衣鍋的轉速25 r·min-1，丸劑成型后,在真空干燥箱65℃,烘干10 h,干燥過程中每2 h翻動一次，以防止局部受熱不均衡,干燥后丸重16 mg，此為模型丸劑。通過均勻設計法U8*(85)，將升麻、山藥、茯苓、火麻仁、僵蠶作為五個因素，丸劑總處方中輔料含量作為8 個水平，處方中5 個中藥細粉具體比例見下（表1）。以泛制法[15,16]制丸、干燥，制備8 批工藝參數相同而輔料配比不同的兩組丸劑[17]，處方中分別加入含量相等的指標成分（鹽酸小檗堿、黃連提取物）。另選擇處方3輔料比例不加指標成分，制成陰性丸劑。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 鹽酸小檗堿

精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.0 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，再精密吸取該溶液1 mL 置25 mL量瓶中，加甲醇配制成39.5 μg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.3.2 黃連提取物

取黃連（片）15 g，加入65%乙醇配置成120 ml，投入多功能提取罐，回流提取3 次，70℃減壓濃縮干燥，將所得提取物濃縮液倒入真空干燥箱，70℃減壓干燥8 h，得黃連提取物。

2.4 物料含量測定

2.4.1 纖維素含量測定

將升麻粉碎，平鋪于稱量瓶中，于105℃下干燥5 h，取濾袋，稱取一定重量，上端打孔后，固定于樣品架上依次經酸洗、水洗、堿洗、水洗、脫脂、干燥、炭化、灰化等，稱重計算差值得出纖維素含量。

2.4.2 多糖含量測定

配置濃度為0.005 7 mg·mL-1的無水葡萄糖對照品，在300-900 nm波長范圍下測最大吸光度。稱取茯苓加入16 倍量蒸餾水，78℃超聲提取48 min，離心，上清液用氯仿-正丁醇（4∶1）萃取2 次，水層加4 倍量95%乙醇，放入冰箱靜置過夜，濾過，殘渣用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，干燥，得粗多糖，粗多糖加蒸餾水定容至50 mL，精密吸取1 mL 溶液加蒸餾水定容至25 mL得樣品溶液，在最大吸收波長下，測定供試液的吸光度值，計算茯苓多糖提取率[18]。

2.4.3 脂肪、淀粉含量測定

制備1 mg·mL-1支鏈和直鏈淀粉對照品溶液，繪制標準曲線。將樣品放105℃鼓風干燥箱中烘干5 h，烘干后放入索氏脂肪提取器中，加入石油醚（30-60℃），加熱回流4 h進行脫脂，再加入85%乙醇，加熱回流4 h進行脫糖，然后放入105℃鼓風干燥箱中烘干，冷卻，稱重，測得脂肪含量。稱取脫水脫糖樣品0.10 g，用少量無水乙醇將其濕潤，再加入1 mol·L-1氫氧化鉀溶液10 mL，沸水浴中進行10 min 的分散溶解，加蒸餾水定容至50 mL，混勻，吸取樣品液4 ml,加入20-30 mL 雙蒸水，用0.1 mol·L-1鹽酸調節(jié)PH至3.0，加0.5 mL碘試劑，用蒸餾水定容。采用UV測得吸光度值，依據回歸方程求出樣品溶液中直鏈淀粉濃度Y值（ug·mL-1）和支鏈淀粉濃度Y值（ug·mL-1），從而得淀粉類中藥中直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉的含量[19]。

2.5 溶出度試驗

按2015 年版《中華人民共和國藥典》收載的測定第二法（漿法）。溶出實驗以900 mL 純化水為溶出介質，轉速100 r·min-1，溫度（37±0.5）℃[14]，實驗前預熱30 min，于2、5、10、20、30、60、120、240、480 min分別取樣，取樣后及時補充相應量溶出介質。

表2 鹽酸小檗堿線性關系考察

圖1 鹽酸小檗堿標準曲線圖

2.6 鹽酸小檗堿方法學考察

2.6.1 標準曲線建立

取2.3.1項下鹽酸小檗堿對照品溶液，分別進樣4、6、8、10、12、14 μL，以進樣量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程：Y=3786.4X-22.76（R2=0.999 9）。結果表明鹽酸小檗堿在0.158 0-0.553 0 ug·mL-1范圍內線性關系良好（表2，圖1）。

2.6.2 精密度實驗

精密稱定同一模型丸劑6份，取供試品溶液，于當日內連續(xù)進樣5 次，記錄峰面積，計算所得RSD=0.77%，表明精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性實驗

精密稱定模型丸劑，于供試品溶液制備后的0、2、4、8、12、24 h，按確定的色譜條件進樣測定，計算其RSD=0.72%，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定。

2.6.4 重復性實驗

精密稱定同一模型丸劑6份，按確定的溶出條件，取4 h 溶出液分別進樣測定，記錄峰面積，計算所得RSD=1.08%，表明樣品處理和液相方法的重復性良好。

2.6.5 加樣回收率考察

取模型丸劑6 g，平行取6 份得溶出液，分別加一定量對照品溶液，0.45 μm 濾膜過濾，按確定的色譜條件進樣測定，結果平均回收率為95.11%，RSD=0.80%。

2.6.7 定量限與檢測限考察

取上述已配置鹽酸小檗堿對照品溶液，倍比稀釋，當信噪比為10∶1 時，鹽酸小檗堿最低檢測質量為0.01 μg·mL-1；當信噪比為3∶1 時，鹽酸小檗堿最低檢測質量濃度為0.003 μg·mL-1，滿足分析的要求。

2.7 黃連總生物堿方法學考察

2.7.1 標準曲線建立

精密吸取過0.45 μm微孔濾膜的溶出液適量稀釋定容至適宜濃度，置于具塞刻度的比色管中，以吸光度為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，標準曲線方程：Y=63.69X+0.018 9（r=0.999 3）。結果表明，在0.002 8-0.013 9 mg·mL-1范圍內，對照品與吸光度呈良好的線性關系（表3）。

表3 黃連總生物堿線性關系考察

2.7.2 精密度實驗

取同一模型丸劑4 h溶出液，于當日內連續(xù)5次測定其吸光度，計算RSD=0.25%，結果表明該儀器日內精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性實驗

取3.4.1 項下穩(wěn)定性實驗，按照確定的溶出條件，取4 h的溶出液處理后于0、2、4、6、10、12 h測定其吸光度，測定其吸光度，由RSD=0.31%，可知該供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7.4 重復性實驗

取任一處方模型丸劑6 g，平行取6 份，同3.4.1 項下重復性實驗，測定其吸光度并計算RSD 值，RSD=1.85%，表明該方法重復性符合規(guī)定。

2.8 物料的測定結果

五種物料含量：山藥（58.55%）＞火麻仁（38.01%）＞升麻（27.21%）＞茯苓（20.11%）＞僵蠶（21.5%），依次減少，但相對都較高，其處方比例對丸劑具有一定影響（表4）。

表4 各物料含量測定結果

2.9 指標成分溶出實驗結果

根據確定溶出方法及色譜條件，分別在2、5、10、20、30、60、120、240、480 min取樣液，選擇溶出480 min的溶出總量作為溶出100%，HPLC 測定樣液中鹽酸小檗堿的含量，8 個中藥丸劑各時間點下溶出液中指標成分累積溶出率（圖2）。處方7 累計溶出率最先達到最大，丸劑組成中山藥含量最高；處方3 為陰性對照，處方4累積溶出率最小，組成中茯苓含量最高。

圖2 鹽酸小檗堿累積溶出百分率

2.9.1 黃連總生物堿溶出實驗結果

各處方中藥丸劑，用紫外分光光度法在2、5、10、20、30、60、120、240、480 min取樣液進樣測定各丸劑體外釋放（圖3）。

圖3 黃連總生物堿累積溶出百分率

處方7 累計溶出率最先達到最大，丸劑組成中山藥含量最高；處方4累積溶出率最小，組成中茯苓含量最高。由圖2和圖3知，8個處方中鹽酸小檗堿和黃連總生物堿的累積溶出百分率具有顯著差異。如處方七與處方三，二者間的溶出差異高達2 倍。其次，8 批丸劑溶出出現拐點處時間為30 min左右，溶出變化最大，其后曲線趨勢逐漸平緩，溶出變化不大。

2.10 中藥物料與溶出參數關系

根據中藥丸劑指標成分的累積溶出百分率，運用Excel（2007）軟件，計算威布爾（Weibull）分布模型[20]，分別擬合并估算各模型處方中單一指標成分及總組分的溶出參數Y（Y為丸劑指標成分藥物溶出30%時，各處方模型的溶出時間（T30）），SPSS 進行線性回歸[21,22]，分析，建立模型，根據上述公式擬合并估算出兩組模型丸劑指標成分溶出參數T30（圖4）。

知鹽酸小檗堿和黃連總生物堿溶出趨勢相似，由此可說明中藥丸劑輔料組成對體外溶出度影響基本一致（圖4）。

為研究中藥物料與丸劑溶出釋放度的關系，引入多元線性數學模型[14]。該數學模型反應五類物料與丸劑溶出度的量變關系[23]。以鹽酸小檗堿為考察指標，測定8 種丸劑的溶解度，根據SPSS20.0 建立回歸模型分析表可知，物料性質與溶出參數之間關系：YT30=0.380--0.116x2+0.023x1x4+0.561x5，以黃連生物堿為指標建立方程：YT30=0.008--0.084x2+0.019x1x4+0.471x5，其中Y代表8個處方指標成分在不同時間點下的溶出百分率，T30代表指標累積溶出30%的時間，x1-x5為纖維類升麻、淀粉類山藥、多糖類茯苓、蛋白類僵蠶、油脂類火麻仁所占處方含量比率。從上述可看出x1、x2與Y呈負相關，x4、x5與Y 呈正相關；從相關性可看出，、x2、x3有促進溶出作用、x1x4、x5有抑制溶出作用，因此可說明x4有抑制溶出的作用，促進溶出的能力：x2＞x3＞＞x1x4＞x5。纖維類、淀粉類以及多糖類物料較難區(qū)分，且從材料學上講，這三類都應為歸屬為多糖類，它們的化學結構都是（C6H10O5）n，通過中藥物料與溶出參數之間的關系方程得出：纖維、淀粉類對模型丸劑中鹽酸小檗堿、黃連總生物堿有顯著的溶出作用（P＜0.05）；蛋白類、油脂類對丸劑中指標成分有顯著的抑制溶出作用(P＜0.05)；多糖類物質對丸劑中指標成分的溶出無顯著作用。

3 討論

3.1 物料分子組成

中藥物料因所富集的成分不同，表現出不同的特征如粉性、纖維性、黏性等，大體分為纖維類、淀粉類、雜多糖、油脂類、樹脂類、礦物類等7 個基本類型。丸劑組成復雜，由多種藥物混合制作而成，因理化性質不同，對溶出度的影響亦不同[3]。細胞吸水后溶脹，成分易溶出，水分子先后透過細胞壁及細胞膜進入內部，進行溶解，然后經擴散進入到體液中[3]。淀粉經長鏈分子卷曲成螺旋形，形成淀粉簇結構[24]；油脂主要成分是高脂肪酸甘油三酸酯，化學結構可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸；纖維素是一種天然有機高分子材料，細胞中含有較多特殊結構的毛細血管；蛋白質由原子間三維關系組成，分四級結構；植物多糖是聚合度超過10個的聚糖，由α-或β-糖苷鍵連接許多相同或不同的單糖[25]。

表5 兩指標成分溶出參數T30

圖4 兩指標成分溶出度T30折線圖

3.2 物料性質對丸劑溶出影響

淀粉、纖維類物料，水份易通過纖維性毛細管，加之淀粉吸水作用較強，吸水后膨脹，丸劑的溶出時間一般較短[3]。油脂類物料遇熱變軟，促使藥粉排列更加緊密、毛細孔徑細?。坏鞍最愇锪显黾邮杷?，減緩成分溶解與擴散；當選取含有大量黏液質、蛋白類、蠟質類、脂肪油脂類等中藥物料，因它們本身具有阻滯劑的作用，內部會形成不溶性骨架，會改變性質，或增加粘性，或增加疏水性，從而減緩丸劑內成分的擴散[3]。多糖的相對分子量越大，水動力體積越大，越不利于多個細胞膜屏障被動擴散進入機體發(fā)揮生物活性；降低相對分子質量可增加多糖的溶解度，從而增強多糖的活性。但是，如果相對分子質量太低，就不能形成活性聚合物結構，導致多糖活性的喪失[26]。

3.3 溶出度實驗

溶出度作為一種可以通過體外試驗替代體內試驗的方法，對處方篩選、工藝條件優(yōu)化，尋找各種制劑在臨床運用無效或效果不理想的原因，考察藥物在不同劑型中的溶出差異性等都有很重要的研究意義。實驗過程中應注意實驗前應預熱、保溫，并保證溶出杯外部水浴高度超過溶出杯中液面高度，以保證整個實驗過程溫度的恒定。溶出介質應脫氣處理，以防止其中氣體影響藥物的釋放等細節(jié)。

后期實驗在選擇指標成分時，應選擇內外指標共同跟蹤研究的方法。選擇依據可以按傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，更傾向于選擇與功能主治相吻合的有效成分、毒性藥物的有效成分等進行體內外評價研究。