吡咯喹啉醌對(duì)脂肪肝蛋雞肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制

趙 芹 張海軍 武書(shū)庚* 岳洪源 王 晶齊廣海* 孫琳琳

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081;2.上海醫(yī)學(xué)生命科學(xué)研究中心有限公司，上海 200032)

脂肪肝綜合征(fatty liver syndrome，F(xiàn)LS)是高峰期產(chǎn)蛋雞常見(jiàn)的一種營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病(發(fā)病率＞15%)，一般發(fā)病突然、死亡率高(有時(shí)高達(dá)30%)?；疾〉半u較難出現(xiàn)產(chǎn)蛋高峰，因而給蛋雞養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。肝臟是家禽脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所，產(chǎn)蛋雞易發(fā)生FLS，這與其脂質(zhì)代謝旺盛、肝細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少有關(guān)。研究表明，脂肪肝在某種程度上就是一種線粒體疾病，線粒體中脂肪酸β氧化減少、氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子生成增加等所形成的惡性循環(huán)是脂肪肝發(fā)生的主要病理過(guò)程［1］。臨床研究表明，通過(guò)藥物或飲食緩解線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激，改善線粒體功能，增加脂肪酸β-氧化等可減輕肝脂變［2］。調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋雞肝臟線粒體功能能否降低FLS發(fā)生，目前尚不清楚。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine，PQQ)是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種新型維生素，可改善線粒體功能。研究表明，PQQ能增加線粒體數(shù)量，減少其損傷，在治療心血管疾?。?］、神經(jīng)退行性疾病［4］、肝損傷［5］等線粒體相關(guān)疾病方面有重要作用。PQQ可通過(guò)提高抗氧化酶活性或直接中和自由基［6］，減少機(jī)體氧化損傷［7］;線粒體受損時(shí)，PQQ能激活線粒體合成通路，促進(jìn)其快速再生，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體動(dòng)態(tài)平衡［8］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，PQQ能提高蛋雞體內(nèi)抗氧化機(jī)能，飼糧中添加PQQ能減少高能低蛋白質(zhì)飼糧引起的蛋雞脂肪肝。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加不同劑量PQQ對(duì)人工誘導(dǎo)(高能低蛋白質(zhì)飼糧)FLS產(chǎn)蛋雞的肝脂質(zhì)代謝和抗氧化作用、肝臟線粒體數(shù)量和功能及肝臟組織病理變化的影響，確定其改善肝臟脂質(zhì)代謝和抗氧化作用是否與肝臟線粒體功能有關(guān)，從而探討PQQ在預(yù)防蛋雞脂肪肝發(fā)生過(guò)程中可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PQQ由微生物發(fā)酵制成，純度＞99.9%，由上海醫(yī)學(xué)生命科學(xué)研究中心有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

選擇產(chǎn)蛋率、體重相近的29周齡海蘭褐蛋雞288只，隨機(jī)分成4個(gè)組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，每個(gè)組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞。預(yù)試期1周，正試期4周。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧;Ⅱ組為病理模型組，飼喂高能低蛋白質(zhì)飼糧;Ⅲ和Ⅳ組為PQQ預(yù)防組，分別在Ⅱ組的高能低蛋白質(zhì)飼糧基礎(chǔ)上添加0.08和0.16 mg/kg的PQQ。

對(duì)照組飼糧參照NRC(1994)和《雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，結(jié)合海蘭褐蛋雞飼養(yǎng)手冊(cè)，配制玉米-豆粕型粉狀飼糧;試驗(yàn)組飼糧除能量、粗蛋白質(zhì)含量不參照上述標(biāo)準(zhǔn)外其他均以此為標(biāo)準(zhǔn)配制而成(表1)。

1.3 飼養(yǎng)管理

采用半開(kāi)放式雞舍3層立體籠養(yǎng)，人工補(bǔ)光加自然光照，人工補(bǔ)光的光照強(qiáng)度20 lx，總光照時(shí)間16 h/d;相對(duì)濕度50% ～90%，自然通風(fēng)與橫向負(fù)壓通風(fēng)結(jié)合。每天布料2次，勻料4次，自由采食和飲水。每日撿蛋2次，清糞2次，每周消毒1次。常規(guī)防疫和管理。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)選取體重相近的蛋雞1只，屠宰，采血，通過(guò)3 000 r/min離心10 min制備血漿，-30℃凍存;取5～8 cm肝組織塊，置10%福爾馬林溶液中固定，用于肝組織病理檢查;另取相同部位肝臟5 g，錫箔紙包裝，液氮速凍，-80℃保存。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.5.1 生化指標(biāo)的測(cè)定

采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肝臟總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定肝臟丙二醛(MDA)含量;比色法測(cè)定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定肝勻漿中總蛋白含量，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。制備肝勻漿:取-80℃凍肝0.5 g，按重量體積比1∶9加入磷酸鹽緩沖液，用 IKA T10高速組織勻漿機(jī)勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清待測(cè)。

1.5.2 肝臟中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的測(cè)定

采用磷酸甘油氧化酶(GPO-PAP)法測(cè)定肝臟中TG和TC含量，試劑盒購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司。制備肝勻漿液:參照Folch等［9］法并略有改動(dòng)。取0.1 g凍肝樣，加入20倍體積的氯仿-甲醇(2∶1，V/V)混合液，勻漿并過(guò)濾。向?yàn)V液中加入0.2倍體積的0.37%KCl溶液，棄上層溶液，用氯仿 - 甲醇 - 水(3∶48∶47，V/V/V)混合液洗滌2次。取肝勻漿用上述試劑盒測(cè)定。

1.5.3 肝細(xì)胞內(nèi)線粒體相對(duì)含量(mtDNA/核DNA)的測(cè)定

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法測(cè)定肝臟線粒體相對(duì)含量:切取肝組織塊，按照試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen)說(shuō)明，提取 DNA(包括線粒體DNA和核DNA)。分別測(cè)定β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和線粒體ATP合酶亞基8(ATP synthase subunit 8，ATP 8)基因。核 DNA和線粒體ATP 8定量，分別用10和0.1 ng DNA做模板。

根據(jù)基因庫(kù)(GenBank)發(fā)表的ATP 8和β-actin基因序列，通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)引物(表2)，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis) %

表2 目的基因及內(nèi)參基因RT-PCR引物Table 2 RT-PCR primes of target gene and reference gene

在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀(CFX96 RT-PCR Detection System，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件:循環(huán)1為94℃ 30 s;循環(huán)2分3步，即94℃5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，重復(fù) 40 次;從 65 ℃ 逐步升溫到95℃采集熔解曲線。線粒體相對(duì)含量的計(jì)算方法采用 2-ΔΔCt線粒體/核，其中:ΔΔCt線粒體/核 =ΔCt線粒體/核(校準(zhǔn)樣)-ΔCt線粒體/核(測(cè)樣)，ΔCt線粒體/核 =Ct線粒體 -Ct核。

1.5.4 肝細(xì)胞線粒體功能測(cè)定

線粒體分離試劑盒分離線粒體，用雙抗體夾心法測(cè)定肝細(xì)胞線粒體中檸檬酸合酶(CS)和細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)活性，用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。肝勻漿制備方法同前。

1.5.5 肝臟組織病理學(xué)觀測(cè)

將固定于10%福爾馬林溶液中的肝臟組織塊切取適宜大小，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精 -伊紅(HE)染色，光鏡觀察，對(duì)肝組織病理變化進(jìn)行評(píng)分。切片由北京集思卓揚(yáng)生物科技公司操作。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)首先經(jīng)Excel 2003處理，采用SPSS 16.0的one-way ANONA程序統(tǒng)計(jì)分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織病理學(xué)觀察

由圖1可知，Ⅰ組蛋雞肝細(xì)胞、肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻，未見(jiàn)炎性病灶和肝細(xì)胞脂肪變性。Ⅱ組蛋雞肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，部分肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞排列紊亂;局部匯管區(qū)、中央靜脈周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);小血管瘀血明顯，局部肝竇隙中可見(jiàn)少量紅細(xì)胞;局部肝細(xì)胞中空泡樣變性和氣球樣變性。PQQ添加組(Ⅲ、Ⅳ組)均表現(xiàn)出不同程度減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，部分肝索排列紊亂，未見(jiàn)炎癥病灶，有輕微的脂肪滴存在。

圖1 各組肝臟組織病理學(xué)觀察Fig.1 Liver histopathological observation in all groups

2.2 肝脂質(zhì)代謝和肝功能指標(biāo)

由表3可知，對(duì)于肝脂質(zhì)代謝指標(biāo)，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肝臟TG和TC含量顯著升高63.07%和137.13%(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組肝臟 TG、TC含量與Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05);與Ⅱ組相比，Ⅲ組肝臟TG和TC含量顯著降低(P＜0.05)，Ⅳ組肝臟TG含量顯著降低(P＜0.05)，TC含量雖有降低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著(P＞0.05);Ⅲ與Ⅳ組之間肝臟中TG、TC含量差異不顯著(P＞0.05)。

對(duì)于肝功能指標(biāo)，與Ⅰ組相比，Ⅱ組血漿中AST和ALT活性未發(fā)生顯著變化(P＞0.05)，Ⅲ和Ⅳ組的ALT活性顯著低于Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。

可見(jiàn)，高能低蛋白質(zhì)飼糧引起的肝臟中TG、TC含量變化，在添加PQQ(Ⅲ、Ⅳ組)后得到顯著改善，添加PQQ為0.08或0.16 mg/kg時(shí)沒(méi)有顯著差異。高能低蛋白質(zhì)飼糧并未引起血漿AST和ALT活性的顯著升高。

2.3 肝臟抗氧化能力

由表4可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肝臟中MDA含量顯著升高了62.50%(P＜0.05)，肝臟中T-SOD活性顯著降低了24.84%(P＜0.05);與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ組肝臟中MDA含量顯著降低(P＜0.05)，肝臟中T-SOD活性顯著升高(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ組之間肝臟中T-SOD活性沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。

表3 飼糧PQQ對(duì)脂肪肝蛋雞肝脂質(zhì)代謝和肝功能的影響Table 3 Effects of dietary PQQ on liver lipid profiles and liver function of fatty liver laying hens

2.4 肝線粒體功能酶活性

由表4可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肝細(xì)胞線粒體內(nèi)CS和CCO活性分別顯著降低了28.35%和34.97%(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組與Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05);與Ⅱ組相比，Ⅲ組的CS和CCO活性分別顯著升高了42.38%和50.66%(P＜0.05)，Ⅳ組CS活性升高了23.71%，但差異不顯著(P＞0.05)，CCO活性顯著升高了47.75%(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組之間CS和CCO活性差異不顯著(P＞0.05)?？梢?jiàn)，飼糧添加PQQ可抑制高能低蛋白質(zhì)飼糧引起的CS和CCO活性降低。

表4 飼糧PQQ對(duì)脂肪肝蛋雞抗氧化能力和肝細(xì)胞線粒體功能的影響Table 4 Effects of dietary PQQ on anti-oxidative capacity and hepatic mitochondrial function of fatty liver laying hens

2.5 肝細(xì)胞線粒體相對(duì)含量

由圖2可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組線粒體相對(duì)含量顯著降低(P＜0.05)，Ⅳ組線粒體相對(duì)含量差異不顯著(P＞0.05)，其中Ⅱ組線粒體相對(duì)含量降低了70.22%，Ⅲ組降低了33.14%。與Ⅱ組相比，Ⅲ組線粒體相對(duì)含量顯著升高了44.01%(P＜0.05)，Ⅳ組線粒體相對(duì)含量顯著升高了124.79%(P＜0.05)。

圖2 飼糧PQQ對(duì)脂肪肝蛋雞肝細(xì)胞線粒體相對(duì)含量的影響Fig.2 Effects of dietary PQQ on hepatic mitochondrial relative content of fatty liver laying hens

3 討論

3.1 PQQ對(duì)脂肪肝蛋雞肝脂質(zhì)代謝和肝功能的影響

脂肪肝能引起蛋雞肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)代謝指標(biāo)升高、肝功能降低等情況［10-11］，以TG含量升高為主要特征。組織學(xué)上定義每單位面積有1/3以上肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，即可判定為脂肪肝。本試驗(yàn)中Ⅱ組蛋雞肝臟組織切片中肝細(xì)胞脂肪變性程度超過(guò)1/3，有的視野中僅見(jiàn)脂肪空泡;且肝臟中TG、TC和LDL-C含量顯著升高，與前人文獻(xiàn)報(bào)道［12］一致。在臨床肝酶學(xué)檢測(cè)上，血漿ALT和AST活性是反映肝損傷的常見(jiàn)指標(biāo)，大部分ALT存在肝細(xì)胞漿內(nèi)，AST存在于細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)。肝臟發(fā)生脂肪病變時(shí)，TG在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積聚，占據(jù)大量空間，迫使肝細(xì)胞腫大破損，轉(zhuǎn)氨酶大量外溢，故血漿ALT活性是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)。本試驗(yàn)中高能低蛋白質(zhì)飼糧引起的血漿ALT活性顯著升高，添加PQQ后基本恢復(fù)到正常值，表明飼糧PQQ能保護(hù)肝臟細(xì)胞免受損傷。PQQ能提高肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β-氧化速率，改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝水平，促進(jìn)對(duì)肝組織中TG的攝取，減少肝內(nèi)脂質(zhì)堆積，降低肝細(xì)胞功能損傷［13-14］，因此PQQ可能通過(guò)上述途徑改善肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝異常。

3.2 PQQ對(duì)脂肪肝蛋雞抗氧化能力的影響

蛋雞采食高能低蛋白質(zhì)飼糧后，可引起線粒體內(nèi)β-氧化增加、電子生成增多、線粒體呼吸鏈中電子泄漏增加、活性氧(ROS)生成增多。同時(shí)，動(dòng)物長(zhǎng)期采食高能低蛋白質(zhì)飼糧導(dǎo)致脂肪代謝障礙，大量TG在肝細(xì)胞內(nèi)積聚，ROS攻擊細(xì)胞內(nèi)不飽和脂肪酸和膜雙分子層中磷脂，加劇細(xì)胞內(nèi)氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷［15］。本研究表明，添加 PQQ可顯著抑制飼喂高能低蛋白質(zhì)飼糧引起的蛋雞肝臟內(nèi)MDA含量顯著升高和T-SOD活性顯著降低。PQQ作為有效的活性氧清除劑，一方面可直接進(jìn)入細(xì)胞線粒體內(nèi)，與氧自由基反應(yīng)，清除過(guò)氧化物、減少細(xì)胞內(nèi)氧化損傷;另一方面還能提高抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，增加蛋雞體內(nèi)抗氧化酶活性，從而減少氧化損傷［16］。

3.3 PQQ對(duì)脂肪肝蛋雞肝細(xì)胞線粒體數(shù)量和功能的影響

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量工廠，是肝臟脂肪酸β-氧化、ATP及ROS形成的主要部位，其在脂肪肝形成中具有重要作用，蛋雞脂肪肝形成可能與過(guò)多自由基生成有關(guān)［16-17］。蛋雞FLS中，線粒體的功能性變化為呼吸鏈紊亂、體內(nèi)ATP水平降低［18］。本試驗(yàn)中，Ⅱ組蛋雞肝細(xì)胞線粒體相對(duì)含量比正常組減少了77.02%，而PQQ組(Ⅲ、Ⅳ組)明顯增加。飼喂缺乏PQQ飼糧的小鼠肝細(xì)胞線粒體相對(duì)含量比PQQ添加組減少了20%～30%［19］;用電子顯微鏡觀察，PQQ添加組小鼠細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯增加，PQQ缺乏組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)較難獲得足夠的線粒體用于測(cè)定線粒體呼吸控制率(RCR)［8］，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。肝細(xì)胞中線粒體數(shù)量的減少，表明肝臟的能量代謝發(fā)生障礙。

CS存在于線粒體基質(zhì)中，是催化三羧酸循環(huán)的限速酶及代謝變化的標(biāo)志酶，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化解毒過(guò)程;CCO位于線粒體內(nèi)膜上，是線粒體呼吸鏈中電子傳遞的終端酶，與ATP的合成直接有關(guān)，其功能異常通常與某些能量代謝疾病的發(fā)生有關(guān)。線粒體CS和CCO活性變化通常用來(lái)反映線粒體功能變化。本試驗(yàn)中高能低蛋白質(zhì)飼糧引起CS和CCO活性的降低，在PQQ組(Ⅲ、Ⅳ組)均得到了顯著改善，與Chowanadisai等［14］報(bào)道的用10～30 μmol PQQ處理小鼠 Hepal-6細(xì)胞24～48 h后線粒體內(nèi)CS和CCO活性明顯增加的結(jié)果一致。

對(duì)于高能低蛋白質(zhì)飼糧引起的線粒體相對(duì)含量的減少和線粒體功能損傷，PQQ可能通過(guò)以下3個(gè)方面發(fā)揮調(diào)控作用。第一，作為電子傳遞體，PQQ在線粒體呼吸鏈中可直接將電子傳遞到細(xì)胞色素C上，形成1個(gè)產(chǎn)能較少的呼吸鏈，從而加速脂肪酸β-氧化，減少呼吸鏈中電子的泄漏和氧自由基生成［20］。第二，提高細(xì)胞內(nèi)與線粒體相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而提高線粒體內(nèi)酶的活性，刺激線粒體合成。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是過(guò)氧化物增殖激活受體協(xié)同激活子-1α(PGC-1α)活化的重要調(diào)節(jié)因子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)線粒體受損時(shí)，PQQ能激活調(diào)控線粒體合成的CREB-PGC-1α通路促進(jìn)線粒體快速合成［13-14］。PQQ能刺激 CREB 133位絲氨酸發(fā)生磷酸化，活化PGC-1α啟動(dòng)子，增加PGC-1α mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)核呼吸因子1/2(NRF-1、NRF-2)活化，刺激線粒體合成。PQQ也可直接促進(jìn)含NRF-1和NRF-2反應(yīng)元件的線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A、B1和 B2(TFAM、TFB1M、TFB2M)mRNA表達(dá)的增加，從而刺激線粒體合成［14］。第三，作為ROS的清除劑，PQQ可直接與線粒體內(nèi)ROS反應(yīng)，維持線粒體內(nèi)ROS生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡，減少氧化應(yīng)激引起的線粒體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和呼吸鏈的失活［6，21］，保障線粒體功能的正常發(fā)揮。目前關(guān)于PQQ對(duì)線粒體作用的研究主要集中在小鼠上，其在蛋雞肝臟內(nèi)的具體作用機(jī)制與上述1條或幾條有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼糧中添加適量PQQ可通過(guò)調(diào)節(jié)產(chǎn)蛋雞脂質(zhì)代謝和抗氧化功能維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡，增加線粒體功能，預(yù)防高能低蛋白質(zhì)飼糧誘發(fā)的FLS，且本試驗(yàn)中當(dāng)飼糧PQQ添加量為0.16 mg/kg時(shí)效果較優(yōu)。

［1］PESSAYRE D.Role of mitochondria in non-alcoholic fatty liver disease［J］.Journal of Gastroenterology and Hepatology，2007，22(1):S20-S27.

［2］BEGRICHE K，IGOUDJIL A，PESSAYRE D，et al.Mitochondrial dysfunction in NASH:Causes，consequences and possible means to prevent it［J］.Mitochondrion，2006，6(1):1-28.

［3］ZHU B Q，ZHU H Z，TEERLINK J R，et al.Pyrroloquinoline quinone(PQQ)decreases myocardial infarct size and improves cardiac function in rat models of ischemia and ischemia/reperfusion［J］.Cardiovascular Drugs and Therapy，2004，18(6):421-431.

［4］HIRAKAWA A，SHIMIZU K，F(xiàn)UKUMITSU H，et al.Pyrroloquinoline quinone attenuates inos gene expression in the injured spinal cord［J］.Biochemical BiophysicalResearch Communications，2009，378(2):308-312.

［5］閔向榮，趙永芳.PQQ對(duì)四氯化碳和乙醇引起大鼠肝損傷的保護(hù)作用［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2001(6):757-760.

［6］徐磊，張海軍，武書(shū)庚，等.吡咯喹啉醌對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及抗氧化功能的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(8):1370-1377.

［7］TAO R，KARLINER J S，SIMONIS U，et al.Pyrroloquinoline quinone preserves mitochondrial function and prevents oxidative injury in adult rat cardiac myocytes［J］.Biochemical and Biophys ical Research Communications，2007，363(2):257-262.

［8］STITES T E，STORMS D，BAUERLY K，et al.Pyrroloquinoline quinone modulates mitochondrial quantity and function in mice［J］.The Journal of Nutrition，2006，136(2):390-396.

［9］FOLCH J，LEES M，SLOANE G H.A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues［J］.The Journal of Biological Chemistry，1957，226(1):497-509.

［10］郭小權(quán)，曹華斌，胡國(guó)良，等.高能量低蛋白質(zhì)日糧中添加生物素對(duì)蛋雞脂類(lèi)代謝的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32(5):754-758.

［11］YOUSEFI M，SHIVAZAD M，SOHRABI H I.Effect of dietary factors on induction of fatty liver-hemorrhagic syndrome and its diagnosis methods with use of serum and liver parameters in laying hens［J］.International Journal of Poultry Science，2005，4(8):568-572.

［12］STEINBERG F M，GERSHWIN M E，BUCKER R B，et al.Dietary Pyrroloquinoline quinone:growth and immune response in BALB/c mice［J］.The Journal of Nutrition，1994，124(5):744-753.

［13］BAUERLY K，HARRIS C，CHOWANADISAI W，et al.Altering pyrroloquinoline quinone nutritional status modulates mitochondrial，lipid，and energy metabolism in rats［J］.PLoS One，2011，6(7):e21779.

［14］CHOWANADISAI W，BAUERLY K A，TCHAPARIAN E，et al.Pyrroloquinoline quinone stimulates mitochondrial biogenesis through cAMP response elementbinding protein phosphorylation and increased PGC-1α expression［J］.The Journal of Biological Chemistry，2010，285(1):142-152.

［15］WEI Y Z，RECTOR R S，THYFAULT J P，et al.Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction［J］.World Journal ofGastroenterology，2008，14(2):193-199.

［16］徐磊.日糧中添加吡咯喹啉醌對(duì)產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和抗氧化機(jī)能的影響［D］.碩士學(xué)位論文.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011:27-29.

［17］郭小權(quán)，胡國(guó)良，曹華斌，等.高能低蛋白日糧致脂肪肝出血綜合征雞抗氧化能力和肝損傷的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30(6):829-832.

［18］OLIVEIRA C P M S，COELHO A M M，BARBEIRO H V，et al.Liver mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the pathogenesis of experimental nonalcoholic fatty liver disease［J］.Brazilian Journal of Medical and Biological Research，2006，39(2):189-194.

［19］BAUERLY K A，STORMS D H，HARRIS C B，et al.Pyrroloquinoline quinone nutritional status alters lysine metabolism and modulates mitochondrial DNA content in the mouse and rat［J］.Biochimica et Biophysica Acta General Subjects，2006，1760(11):1741-1748.

［20］SMITH R A，HARTLEY R C，COCHEME H M，et al.Mitochondrial pharmacology［J］.Trends in Pharmacological Sciences，2012，33(6):341-352.

［21］GONG D，GENG C，JIANG L，et al.Effect of pyrroloquinoline quinone on neuropathic pain following chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats［J］.European Journal of Pharmacology，2012，697(1/2/3):53-58.