海蘭褐殼蛋雞含黃素單氧化酶3基因型頻率分布及其對蛋品質的影響

王 晶 武書庚 張海軍 岳洪源 齊廣海

(中國農業(yè)科學院飼料研究所，農業(yè)部飼料生物技術重點開放試驗室，北京 100081)

蛋雞的魚腥味綜合征(fish odour syndrome)系由含黃素單氧化酶3(flavin-contain monenzyme，FMO3)基因突變導致雞體無法正常代謝三甲胺(trimethylamine，TMA)，從而沉積于卵泡中，形成魚腥味雞蛋。近年來，消費者對畜禽產品安全性、營養(yǎng)保健性、風味等要求不斷提高，其中，魚腥味嚴重影響了雞蛋的風味和可接受性。通過標記輔助選擇可以剔除群體中易感基因型個體，減少魚腥味雞蛋的檢出率，提高雞蛋品質。因此，需要了解突變基因型個體在雞群中的分布及基因型對雞蛋風味的影響。1932年，Vondell首次報道了魚腥味雞蛋;1973年，確定TMA是引起雞蛋魚腥味的主要物質，95%存于蛋黃中［1］。TMA生成的前體物質有芥子堿、膽堿、氧化三甲胺等，當飼糧中添加菜籽及其加工物、魚粉或膽堿時極易誘發(fā)魚腥味蛋的產生［2-5］。正常情況下，體內產生的TMA在肝臟FMO3催化下，生成無味的氧化三甲胺，隨尿液代謝出體外。通過雞FMO3基因測序，發(fā)現位于編碼區(qū)第984個堿基位置的突變［由腺嘌呤(A)突變成胸腺嘧啶(T)］與蛋雞魚腥味綜合征顯著相關，該位點引起FMO3第329個氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，導致FMO3功能異常［6］。在人和牛上的研究也表明，FMO3基因突變能夠引起魚腥味綜合征［7-8］。針對T329S位點的變化，可將蛋雞個體分為AA(野生型)、AT(雜合型)和TT(突變型)基因型。FMO3基因位于雞的8號染色體末端，所在區(qū)域包括多個與經濟性狀有關的基因和數量遺傳位點［9］。相關研究多集中于基因型、前體物質水平對雞蛋TMA含量的影響上，然而關于基因型頻率分布、基因型對蛋品質的影響等方面報道較少。本試驗旨在檢測FMO3 T329S突變位點在我國商品代海蘭褐殼蛋雞群體中的分布，觀察基因型對蛋品質和雞蛋TMA含量的影響，為雞蛋魚腥味的研究積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 海蘭褐產蛋雞FMO3基因型頻率分布

1.1.1 試驗動物

試驗從中國農業(yè)科學院飼料研究所留民營蛋雞試驗基地隨機選擇150日齡海蘭褐蛋雞800只作為試驗雞。

1.1.2 基因組DNA提取及聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系及程序

每只雞翅下靜脈采血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP318)提取 DNA。根據 GenBank上雞FMO3的基因序列(GI:AJ431390)，針對 T329S位點設計引物，引物序列為:上游5＇-ATGAGGCTATCTGTTCCCAAAG-3＇，下 游 5＇-GACCAATCCAATGACTGCCA-3＇，擴增片段長度為397 bp。

PCR 擴增反應體系為 10 μL:dd H2O 8 μL，10 μmol/L上下游引物各 0.1 μL，10 × Taq PCR Mix 1 μL，DNA 模板 0.3 μL，DreamTaq(5 U/μL)0.06 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μL。PCR 反應程序為95℃ 5 min;94℃ 30 s，66.1℃ 30 s，72℃30 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保溫。

1.1.3 酶切反應體系及程序

采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析方法(PCR-RFLP)檢測個體基因型，限制性內切酶為BsrⅠ，該內切酶所切序列為:5＇-ACTGGN↓-3＇，3＇-TGAC↑CN-5＇。其中箭頭所指位置為酶切位點，酶切溫度65℃，時間4 h。酶切體系20 μL:PCR 產物 10 μL，dd H2O 7 μL，10 × Buffer 2 μL，BrsⅠ酶 1 μL。酶切完成后，2% 的瓊脂糖凝膠(含0.3%Golden View)電泳檢測，EDAS290凝膠成像(Kodak公司)系統(tǒng)觀察結果。

1.2 FMO3基因型對蛋品質和雞蛋TMA含量的影響

1.2.1 試驗設計

46周齡時，選用已確定FMO3基因型海蘭褐產蛋雞120只，分為3個組，其中AT基因型、TT基因型各54只，每組6個重復，每個重復9只;AA基因型12只，每組6個重復，每個重復2只。預試期1周，試驗期6周。

1.2.2 試驗飼糧和飼養(yǎng)管理

參照《雞的飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)，配制玉米-豆粕型試驗飼糧(表1)。所有參試蛋雞采用相同的常規(guī)飼養(yǎng)管理。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet %

1.2.3 測定指標及方法

蛋品質測定:于試驗第40～42天，每重復收集6枚雞蛋(AA基因型收集4枚)，4℃保存。蛋黃顏色、蛋白高度、哈夫單位采用雞蛋品質測定儀(以色列ORKA Food Technology Ltd.)測定;蛋殼厚度用蛋殼厚度測量計(ESTG-1，以色列ORKA Food Technology Ltd.)測定;蛋殼強度用蛋殼強度分析儀(Egg Force Reader，以色列 ORKA Food Technology Ltd.)測定。

雞蛋 TMA 測定:試驗第7、14、21、28、35 和42天，每重復取3枚蛋，分離蛋黃，混勻，取50 mL于-20℃保存，記錄蛋重和蛋黃重。采用苦味酸比色法［10］測定蛋黃TMA含量。

1.3 數據統(tǒng)計分析

海蘭褐產蛋雞FMO3基因型頻率分布:根據PCR-RFLP檢測結果，統(tǒng)計不同基因型個體數量，計算群體基因頻率和基因型頻率，采用SPSS 16.0中的卡方檢驗進行哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡性檢測。

FMO3基因型對產蛋雞蛋品質影響:采用SPSS 16.0軟件的one-way ANOVA程序進行統(tǒng)計分析，Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 海蘭褐產蛋雞FMO3基因型頻率分布

2.1.1 PCR-RFLP分析

根據設計引物擴增出的條帶特異性較好，大小與理論值一致。酶切結果(圖1)表明，TT基因型為1條帶，397 bp;AA基因型為2條帶，267和130 bp;AT基因型為3條帶，分別為397、267和130 bp。

圖1 FMO3基因突變位點的PCR-RFLP檢測Fig.1 PCR-RFLP detect of mutation in FMO3 gene

2.1.2 序列分析

對FMO3基因在海蘭褐蛋雞血液DNA中的擴增片段突變情況進行分析，將AA、AT和TT基因型個體的PCR擴增產物進行測序，結果見圖2。圖2中黑框標明變異位點。通過測序檢驗，表明采用PCR-RFLP檢測能準確地針對T329S位點分離篩選FMO3基因型。

圖2 FMO3基因序列對比Fig.2 Sequence comparison of FMO3 gene

2.1.3 基因型頻率及等位基因頻率分析

根據PCR-RFLP檢測結果，統(tǒng)計海蘭褐殼蛋雞群體內FMO3基因型頻率及等位基因頻率(表2，有效數據731只)。在海蘭褐蛋雞品系內，對該位點而言，AT和TT基因型頻率明顯地高于AA基因型，T等位基因頻率高于A等位基因。用卡方檢驗對FMO3基因型分布進行服從Hardy-Weinberg平衡的檢驗，表明該基因在海蘭褐蛋雞品系內極顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡(P＜0.001，表 3)。

表2 海蘭褐殼蛋雞FMO3基因型頻率及等位基因頻率Table 2 Frequencies of genotype and allele of FMO3 gene of Hy-Line brown laying hens

表3 FMO3基因T329S位點Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 3 Hardy-Weinberg equilibrium test for T329S site of FMO3 gene

2.2 FMO3基因型對蛋品質和雞蛋TMA含量的影響

由表4可知，FMO3基因型對雞蛋常規(guī)品質無顯著影響(P＞0.05)。由表5可知，FMO3基因型顯著影響了蛋黃TMA含量(P＜0.05)。試驗第7天，TT基因型蛋黃中TMA含量顯著高于AA基因型(P＜0.05)，而與AT基因型無顯著差異(P＞0.05);試驗第35和42天，TT基因型蛋黃中TMA含量顯著高于AA和AT基因型(P＜0.05)。

表4 FMO3基因型對蛋雞蛋品質的影響Table 4 Effects of FMO3 genotype on egg quality of laying hens

表5 FMO3基因型對蛋黃三甲胺含量的影響Table 5 Effects of FMO3 genotype on TMA content in egg yolks μg/g

3 討論

3.1 海蘭褐產蛋雞FMO3基因型頻率分布

雞蛋的魚腥味問題一直困擾著蛋雞生產者和學者。20世紀70年代，有學者提出雞的常染色體半顯性基因突變引起FMO3活性降低是導致產生腥味蛋的遺傳因素［11-12］。研究證實，FMO3是體內TMA代謝的唯一有效酶［13］。因遺傳背景及選育程度等因素影響，T329S突變位點在各雞種中的分布不同。伊莎褐蛋雞群體中，TT基因型頻率約 15%［6，14］;羅曼褐蛋雞經剔除突變位點后，突變基因型頻率已從 14.44%［6］降到了1.00%［14］。我國地方雞種中，絲羽烏骨雞TT基因型頻率高達60.40%［15］，太 湖 雞 為 20.40%，北 京 油 雞 為14.60%［16］。本試驗中，海蘭褐蛋雞TT基因型個體數占群體20.0%，與Ward［14］的檢測結果相似(檢測個體數 598只，AA 1%，AT 79%，TT 20%)。張龍超［15］所測父母代海蘭褐母系(檢測個體數79只)FMO3基因型頻率分別為68.4%(AA)、17.7%(AT)、13.9%(TT)。二者結果都顯示該位點在海蘭褐蛋雞群體中均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。由于試驗選用的為商品代蛋雞，對該品系的培育和對經濟性狀的人為選擇可能是造成FMO3基因型分布不平衡的主要原因。

3.2 FMO3基因型對蛋品質和雞蛋TMA含量的影響

FMO3基因型對雞蛋常規(guī)品質的影響報道較少。本試驗結果表明，基因型對蛋品質無顯著影響。此外，基因型間蛋黃比例、含水量、粗蛋白質和粗脂肪含量都無顯著差異(數據未顯示)。因此選育過程中，可忽略對雞蛋上述品質的影響。

雞蛋中TMA含量受遺傳因素和營養(yǎng)因素的共同作用。T329S突變導致FMO3酶活性的下降是造成TT基因型個體代謝TMA異常的遺傳因素［10］。FMO3基因型對蛋黃TMA含量的影響主要表現為高劑量前體物存在時，TT和AT基因型蛋雞蛋黃TMA含量顯著升高。而常規(guī)水平添加氯化膽堿(0～2 200 mg/kg)可被雞體充分吸收，導致無足夠的膽堿進入盲腸用于TMA的生成，不會誘發(fā)突變個體的魚腥味綜合征［2，5，17］。本試驗中，受飼糧前體物劑量所限，雞蛋TMA含量低于嗅覺閾值，雖未表現出魚腥味，但可見TT基因型蛋雞TMA代謝的異常，提示生產中需注意TT基因型個體對雞蛋風味的潛在危害。

感官可探測全蛋中TMA的最低含量約為1 μg/g［18］，蛋黃中為 3.79 μg/g［19］。消費者可以接受蛋黃中TMA含量略高于感官檢測基準點的雞蛋［5］。本試驗中，TT基因型蛋雞雞蛋TMA含量在第7、35和42天時顯著高于AA基因型，最大值為3.58 μg/g，均低于人們的嗅覺閾值，在可接受性范圍內。

4 結論

商品代海蘭褐殼產蛋雞群體中(n=731)，AA、AT和TT基因型頻率分別為3.4%、76.6%和20.0%，偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。飼糧中常規(guī)水平添加氯化膽堿，可見TT基因型蛋雞TMA代謝異常，但不會誘發(fā)產生魚腥味雞蛋。

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