藏香豬源纖維素分解菌的分離鑒定及酶學(xué)特性分析

楊偉平 孟凡旭 馬 麗 姬生躍 曹斌云*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100;2.洛陽師范學(xué)院，洛陽 471022)

藏香豬是在我國青藏高原高海拔地區(qū)的缺氧、寒冷、放牧條件下培育出的具有耐寒、抗病、食草、肉香、環(huán)保等優(yōu)良特性的草食豬種，其在舍飼條件下仍可用90%的飼草來滿足其營養(yǎng)需要［1］。因此，研究藏香豬的食草特性對(duì)于發(fā)展我國節(jié)糧型養(yǎng)豬業(yè)意義重大。目前，我國對(duì)藏香豬的研究主要集中在生長發(fā)育［2-3］、肉品質(zhì)［4-5］及繁殖性狀［6-7］等方面，對(duì)其高效利用粗纖維飼料這一優(yōu)良特性的研究甚少。國內(nèi)外大量研究表明，動(dòng)物腸道的正常菌群與其營養(yǎng)及消化生理具有密切的關(guān)系，以草食為主的反芻動(dòng)物，其瘤胃中50%纖維素的消化是由瘤胃細(xì)菌、真菌和原蟲共同完成的，而在這一消化過程中80%由細(xì)菌完成［8-9］。此外，像大熊貓這種既有草食性哺乳動(dòng)物的進(jìn)食特點(diǎn)、又有肉食性消化系統(tǒng)的動(dòng)物，對(duì)纖維素的消化也必須依賴其腸道特殊微生物的作用［10］。豬是雜食動(dòng)物，胃的結(jié)構(gòu)和機(jī)能屬于肉食與草食復(fù)胃動(dòng)物之間的過渡類型，同時(shí)具有發(fā)達(dá)的大腸。豬的消化腺雖然不能分泌纖維素酶，但在大腸纖維素分解菌的作用下，能分解纖維素作為能源供機(jī)體利用，而這種菌株主要存在盲腸［11］。藏香豬之所以能夠?qū)暡葑鳛橹饕獱I養(yǎng)來源，可能與其腸道內(nèi)存在能夠高效分解纖維素的纖維素分解菌有關(guān)。本試驗(yàn)擬采用羧甲基纖維素(CMC)平板法初篩和搖瓶發(fā)酵法復(fù)篩，從藏香豬盲腸內(nèi)容物中分離和篩選能夠高效分解纖維素的菌株，以揭示藏香豬能夠高效利用粗纖維飼料的根源，為藏香豬食草機(jī)理的研究以及豬源益生菌株的開發(fā)利用提供菌種來源與研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源與采集

試驗(yàn)樣品于2012年9月采集于陜西華益實(shí)業(yè)有限公司藏香豬養(yǎng)殖基地的8月齡健康藏香豬。藏香豬的飼料主要為青草(90%)，配以少量豆渣(10%)。屠宰后剖開腹腔，迅速分離盲腸，取20 cm左右的腸段，并在腸管兩端用線繩結(jié)扎、剪斷，裝封口塑料袋中排氣封口，放入冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用于分離腸道細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

CMC 篩選培養(yǎng)基［12-13］:CMC 10.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母粉0.5 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.5 g，七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.2 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨提取物10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基［14］:LB液體培養(yǎng)基中加入1.0%的CMC。

1.1.3 主要試劑和儀器

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、pGEM-T克隆載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)菌基因組DNA試劑盒、小型質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、pGEM-T Easy載體購自北京天根生化科技有限公司，胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自O(shè)xoid公司，CMC購自Sigma公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)所用主要儀器有:PTC-1148型PCR儀、BG-gdsAUTO(510)型凝膠成像系統(tǒng)、ND-1000型紫外分光光度計(jì)、Beckman Coulter Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素分解菌的初篩

稱取藏香豬盲腸內(nèi)容物1.0 g，轉(zhuǎn)移至盛有100 mL無菌水的三角瓶中，在80℃電熱恒溫振蕩水浴鍋中振蕩30 min，即成10-2盲腸內(nèi)容物稀釋液，取適量梯度稀釋為10-6～10-3樣液。然后分別取100 μL稀釋過的樣液涂于相應(yīng)稀釋梯度編號(hào)的CMC平板上，CMC平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用剛果紅染色法對(duì)菌株進(jìn)行篩選［15］。根據(jù)菌落周圍透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值大小對(duì)活力強(qiáng)的菌株進(jìn)行初步篩選。對(duì)D/d值大的菌落在CMC平板上反復(fù)劃線分離純化培養(yǎng)4～5代，并將純化培養(yǎng)的菌種加甘油于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 纖維素分解菌種子液的制備及復(fù)篩

將冷凍保存的D/d值大的菌種在LB平板上劃線活化培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取少量單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、220 r/min條件下?lián)u菌培養(yǎng)12 h，然后再轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)1～2次。最后以1.0%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)12 h，制備成種子液。

將種子液以1.0%的接種量接種入50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃、220 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，于5 000 r/min、4℃條件下離心發(fā)酵液15 min，上清液即為粗酶液，對(duì)粗酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用于羧甲基纖維素酶(CMCase)比活力的測定，最終以CMCase比活力高低作為篩選高產(chǎn)纖維素菌株的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 CMCase比活力測定

CMCase比活力的測定是通過測定還原糖的生成量來進(jìn)行，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考Miller［16］的方法進(jìn)行。在試管中加入2.0 mL培養(yǎng)物的上清液和2.0 mL 1.0%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，在pH 5.5的0.1 mol/L醋酸緩沖液中，40℃水浴條件下準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，加入5 mL 3，5-二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)，沸水煮沸5 min，冷卻且用蒸餾水定容至25 mL后在540 nm處測吸光度(OD)值。粗酶液中每克酶蛋白所具有的酶活力定義為1個(gè)比活力，用U/g表示。

1.3 選定纖維素分解菌的鑒定

菌株形態(tài)學(xué)特征鑒定用革蘭氏染色法［17］和孔雀石綠芽孢染色法［18］，生理生化特性鑒定參考東秀珠等［19］和 Garrity 等［20］的方法進(jìn)行。為進(jìn)一步確認(rèn)，提取菌株基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物(27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3＇，1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)［21］對(duì)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR純化產(chǎn)物和pGEM-T進(jìn)行T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序由北京華大基因生物公司完成。將測序結(jié)果在NCBI上用BLAST程序與GenBank中16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，用Mega 5.1中的鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 選定纖維素分解菌的生長特性及產(chǎn)酶能力研究［17］

將種子液以1.0%的接種量接入100 mL LB液體培養(yǎng)基，6 h后每間隔2 h取樣1次，31 h后每隔4 h取樣1次，直至60 h。測定時(shí)將培養(yǎng)液均稀釋10倍，采用分光光度法測定600 nm處的OD值，繪制菌株生長曲線。此外，將種子液以1.0%接種量接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃、220 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)，研究選定纖維素分解菌不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)酶能力。

1.5 選定纖維素分解菌的酶學(xué)特性研究［22-24］

試驗(yàn)菌株酶學(xué)特性研究的具體方法參考李忠玲等［22］、Mawadza 等［23］和劉海艷等［24］研究中的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌株的分離篩選

在需氧條件下，通過CMC平板法初篩，篩選出了10株透明圈明顯的菌株，然后將初篩的菌株反復(fù)劃線分離純化培養(yǎng)4～5代，結(jié)合搖瓶發(fā)酵法復(fù)篩，最終確定選用發(fā)酵24 h時(shí)纖維素酶比活力最強(qiáng)的菌株C9(36.4 U/g)用于深入研究(表1)。將菌株C9點(diǎn)種于CMC平板上培養(yǎng)24 h，剛果紅染色法染色后，菌落周圍仍有很大的透明圈，說明該菌株具有強(qiáng)的分解CMC的能力，并且這種能力能夠穩(wěn)定遺傳給后代(圖1)。

2.2 菌株C9的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，纖維素分解菌株C9菌落表面粗糙不透明，灰白色或微黃色，屬于需氧菌;革蘭氏染色陽性，顯微鏡下菌體呈桿狀(圖2);用改良的孔雀石綠染色法進(jìn)行芽孢染色后，芽孢被染成綠色，呈長橢圓狀，位于菌體中央或稍偏，營養(yǎng)體呈紅色(圖3)。

表1 纖維素分解菌的分離篩選Table 1 Isolation and screening of cellulolytic bacterium

2.2.2 生理生化特性鑒定

根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，從試驗(yàn)菌株的生理生化特性鑒定結(jié)果(表2)看，本試驗(yàn)中篩選到的菌株C9可初步鑒定為芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或其變種。

2.2.3 16S rRNA分子鑒定

測序結(jié)果表明，菌株C9的16S rRNA基因序列長度為1 511 bp，其大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)。在NCBI上用BLAST程序?qū)闏9的16S rRNA基因測序結(jié)果(GenBank登錄號(hào):KC414931)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，菌株C9與多株芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列相似性達(dá)99%以上。從Mega 5.10構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)看，該菌株與Bacillus subtilis subsp.subtilis strain DSM 10(GenBank登錄號(hào):NR_027552.1)親緣關(guān)系最近。綜合該菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性鑒定結(jié)果，以及16S rRNA基因分子學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定該菌株為Bacillus sublitis的一個(gè)亞種或變種，將其命名為Bacillus sublitis BY-2。該菌株目前已被中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏號(hào)為:CCTCCM 2012535。

2.3 Bacillus sublitis BY-2的生長特性分析

從圖6生長曲線看，Bacillus sublitis BY-2在接種后8～20 h為對(duì)數(shù)期，20 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，并且持續(xù)至40 h左右，40 h后菌體的繁殖逐漸進(jìn)入衰退期。

圖1 菌株C9在CMC平板上的透明圈Fig.1 Transparent circle of strain C9 on CMC plate

圖2 菌株C9的革蘭氏染色Fig.2 Gram staining of stain C9(1 000×)

圖3 菌株C9的芽孢染色Fig.3 Spore staining of stain C9(1 000×)

2.4 Bacillus sublitis BY-2不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)酶能力分析

將種子液按1.0%接種量接種，在發(fā)酵的不同時(shí)間測定Bacillus sublitis BY-2所產(chǎn)CMCase的比活力。結(jié)果表明，在28 h內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，Bacillus sublitis BY-2的產(chǎn)酶能力也逐漸增大，在發(fā)酵至28 h時(shí)CMCase的比活力達(dá)到最高(46.2 U/g)，隨后CMCase的比活力略有下降，但基本保持穩(wěn)定(圖7)。

表2 菌株C9的生理生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics of strain C9

圖4 菌株C9 16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR products of 16S rRNA gene of strain C9

2.5 Bacillus sublitis BY-2的酶學(xué)特性分析

由圖8可知，Bacillus sublitis BY-2產(chǎn)CMCase的最適反應(yīng)pH為5.5。將Bacillus sublitis BY-2的粗酶液與不同pH的緩沖液混勻，在40℃水浴保溫1 h后，與最適反應(yīng)pH相比，其所產(chǎn)CMCase的相對(duì)比活力在pH 3～8的范圍內(nèi)均在80%以上(圖9)，說明 Bacillus sublitis BY-2所產(chǎn) CMCase具有較強(qiáng)的耐酸堿性。

在最適pH條件下，Bacillus sublitis BY-2產(chǎn)CMCase的最適反應(yīng)溫度為65℃(圖10);將Bacillus sublitis BY-2的粗酶液分別在不同溫度下水浴保溫1 h，其所產(chǎn)CMCase的比活力在50℃以上時(shí)迅速下降，在80℃時(shí)幾乎失活(圖11)。

此外，在最適反應(yīng)pH及最適反應(yīng)溫度條件下，在反應(yīng)5 min時(shí) CMCase比活力最高(138.1 U/g)，隨著與底物反應(yīng)時(shí)間的延長，Bacillus sublitis BY-2所產(chǎn)CMCase的比活力逐漸降低，至30 min后CMCase比活力變化不大(圖12)。

圖5 菌株C9 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of strain C9

3 討論

3.1 纖維素分解菌的分離與篩選

纖維素是植物通過光合作用生產(chǎn)的地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源［25］。由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶結(jié)構(gòu)，其外圍又被木質(zhì)素層包圍著，要把它水解成可利用的葡萄糖相當(dāng)困難。此外，高成本的纖維素酶也是利用纖維素的障礙，因此，纖維素到目前為止仍沒有得到很好地利用［26］。在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中，為了緩解目前能量飼料短缺的局面，高產(chǎn)纖維素分解菌種的分離篩選一直被人們重視。真菌所產(chǎn)的纖維素酶因種類齊全而被應(yīng)用于食品、飼料、紡織、燃料和化學(xué)工業(yè)等生產(chǎn)領(lǐng)域中［27-28］。但真菌生長慢，生產(chǎn)纖維素酶成本高，因此，篩選具有培養(yǎng)簡單、生長速度快、世代周期短等特點(diǎn)的纖維素分解菌具有較高的潛在應(yīng)用性［29］。

以CMC為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，用剛果紅染色法來初步分離篩選纖維素分解菌，因簡單快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛認(rèn)為是初步篩選纖維素分解菌最好的方法［15］。目前，人們已從牛的瘤胃［30-32］，犀牛［33］、藏香豬［24］以及大熊貓［12］的糞便，土壤［34］，鵝的胃腸道［35］以及海洋細(xì)菌［36］等中分離出來了纖維素分解菌，主要有芽孢桿菌、梭菌、纖維菌屬、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬等［37-38］。

圖6 Bacillus sublitis BY-2的生長曲線Fig.6 Growth curve of Bacillus sublitis BY-2

圖7 Bacillus sublitis BY-2不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)酶能力Fig.7 Enzyme-producing ability of Bacillus sublitis BY-2 at different fermentation time

圖8 pH對(duì)CMCase比活力的影響Fig.8 Effect of pH on CMCase specific activity

圖9 pH對(duì)CMCase穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on CMCase stability

圖10 溫度對(duì)CMCase比活力的影響Fig.10 Effect of temperature on CMCase specific activity

圖11 溫度對(duì)CMCase穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of temperature on CMCase stability

圖12 時(shí)間對(duì)CMCase比活力的影響Fig.12 Effect of time on CMCase specific activity

本試驗(yàn)將采集到的藏香豬盲腸內(nèi)容物用蒸餾水適當(dāng)稀釋后，在80℃振蕩水浴條件下振蕩30 min，將不含芽孢的菌體及雜菌殺死，然后通過反復(fù)初篩和復(fù)篩，篩選出了1株能夠高效分解纖維素的菌株Bacillus subtilis BY-2。該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)至24 h時(shí)，其所產(chǎn)CMCase比活力高于Sadhu等［39-40］所報(bào)道的結(jié)果，但低于 Wang 等［41］所報(bào)道的真菌所產(chǎn)CMCase的比活力。

3.2 Bacillus subtilis BY-2的生長特性與產(chǎn)酶能力

在微生物生長繁殖的過程中，種齡、種子液的濃度、接種量的大小、菌體培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分等對(duì)其生長和代謝均有重要的影響［42］。本試驗(yàn)篩選的Bacillus subtilis BY-2菌株在接種8 h后生長開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，并且持續(xù)至 40 h 左右，與汪海峰等［43］、高穎等［44］的試驗(yàn)結(jié)果基本一致，但卻有別于殷曉敏等［45］的試驗(yàn)結(jié)果。從Bacillus subtilis BY-2在不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)酶能力看，其產(chǎn)酶特性與生長特性基本吻合，即:在8～20 h這一時(shí)期生長最快，為代謝旺盛、酶系活躍階段;在20～40 h之間，進(jìn)入穩(wěn)定產(chǎn)酶階段。在菌種選育過程中，生長速率快、產(chǎn)酶早、產(chǎn)酶量高的菌株常作為篩選的目標(biāo)菌株，因?yàn)樵谖⑸锏墓I(yè)生產(chǎn)中，菌體在單位時(shí)間內(nèi)合成的目標(biāo)產(chǎn)物的數(shù)量是生產(chǎn)成本的決定性因素［46］。另外，當(dāng)產(chǎn)酶量高、生長速率快的菌株作為益生菌飼喂動(dòng)物時(shí)，能夠短時(shí)間在腸道內(nèi)生長繁殖，維持腸道內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)衡［43］。

3.3 Bacillus subtilis BY-2的酶學(xué)特性

研究表明，在纖維素酶系中作用于底物的最適pH大多在4.0～5.5之間［47］，雖然酶促反應(yīng)pH較為集中，但又不統(tǒng)一，這可能與菌株來源等因素有關(guān)。本試驗(yàn)篩選出的Bacillus subtilis BY-2所產(chǎn)CMCase的最適反應(yīng)pH為5.5，與 Mawadza等［23］所報(bào)道的芽孢桿菌的試驗(yàn)結(jié)果基本一致，但低于Kim 等［36］、劉海艷等［24］、Lee 等［48］所報(bào)道的芽孢桿菌的試驗(yàn)結(jié)果，而高于 Rawat等［49］、Rastogi等［50］所報(bào)道的芽孢桿菌的試驗(yàn)結(jié)果。此外，Bacillus subtilis BY-2所產(chǎn)CMCase在寬pH范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，這也是芽孢桿菌屬細(xì)菌所產(chǎn)CMCase的共同特點(diǎn)［23］。

Bacillus subtilis BY-2產(chǎn)CMCase的最適反應(yīng)溫度為65℃，且在65～70℃范圍內(nèi)CMCase的比活力幾乎維持在同一個(gè)水平，與Mawadza等［23］所報(bào)道的芽孢桿菌的試驗(yàn)基本一致，高于Lee等［48］和 Kim 等［36］、Rawat等［49］所報(bào)道的芽孢桿菌的試驗(yàn)結(jié)果，而低于Rastogi等［50］所報(bào)道的芽孢桿菌的試驗(yàn)結(jié)果。

Bacillus subtilis BY-2所產(chǎn)CMCase在最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，其比活力逐漸降低，30 min后曲線逐漸呈現(xiàn)水平狀態(tài)。該試驗(yàn)結(jié)果與姜心等［51］的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加，逆反應(yīng)從無到有，逐漸變得顯著;同時(shí)，酸、熱等因素也慢慢地使酶喪失部分活性。此外，酶反應(yīng)的時(shí)間也與反應(yīng)溫度有關(guān)，反應(yīng)時(shí)間延長，反應(yīng)溫度降低，反之則升高［52］。

4 結(jié)論

① 根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rRNA分子鑒定，將從藏香豬盲腸內(nèi)容物中分離出的纖維素分解菌命名為Baclitis sublitis BY-2。

② 酶學(xué)特性分析表明，Baclitis sublitis BY-2產(chǎn)CMCase的最適反應(yīng)條件為:pH 5.5、65℃下反應(yīng)5 min。

③Baclitis sublitis BY-2生長速率快、產(chǎn)酶早、產(chǎn)酶能力強(qiáng)，且在pH 3～8的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的耐酸堿性，為細(xì)菌纖維素酶和微生態(tài)制劑的研發(fā)與生產(chǎn)提供了菌種來源與研究基礎(chǔ)。

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