星形膠質(zhì)細(xì)胞活化在心理應(yīng)激影響大鼠咬肌痛覺敏感中的作用

劉 楊，張 旻，趙雅娟，王 艦，趙蕊妮，陳永進(jìn)

(陜西西安710032:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院急診與綜合臨床科軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室)

頜面部咀嚼肌疼痛是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病最常見的癥狀之一，與精神心理因素有著密切的關(guān)系［1-2］，本課題組前期研究表明心理應(yīng)激能夠?qū)е麓笫缶捉兰⊥从X敏感性增高［3］。近年來的研究顯示，延髓的三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(Vc)［4］既是頜面部信息整合的關(guān)鍵核團(tuán)，又是痛覺信息向中樞傳導(dǎo)的第一門戶，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了多種類型的疼痛，并與疼痛的惡化和維持密切相關(guān)［5-6］。那么，Vc內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在心理應(yīng)激致咀嚼肌痛覺敏感的過程中起怎樣作用，目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞在心理應(yīng)激所致咀嚼肌疼痛過程中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討心理應(yīng)激后口頜面疼痛的中樞機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

雄性Sprague-Dawley大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);自制束縛器;RD1412-OF曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、RD1208-EP高架十字迷宮(上海Mobile-datum公司);BCA蛋白定量試劑盒(上海西唐生物科技有限公司);鼠單抗GFAP、DAB顯色劑、ECL發(fā)光液(Abcam公司，英國);發(fā)光儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 心理應(yīng)激動(dòng)物模型的建立

取體質(zhì)量(200～220)g SD大鼠40只，隨機(jī)分為1個(gè)空白對(duì)照組和束縛應(yīng)激3、7、14 d 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只。然后參照文獻(xiàn)［7］報(bào)道的方法對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠分別進(jìn)行束縛應(yīng)激處理3、7、14 d，每天9∶00～17∶00共8 h，應(yīng)激期間大鼠禁食禁水;空白對(duì)照組大鼠不做任何處理。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均在室溫(22±2)℃條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，每天光照12 h，自由飲水、進(jìn)食。

1.3 行為學(xué)測(cè)試

應(yīng)激結(jié)束后分別采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠的行為學(xué)進(jìn)行測(cè)試。每組實(shí)驗(yàn)完成后均徹底清理實(shí)驗(yàn)箱，并噴灑750 mL/L乙醇以消除大鼠殘留的氣味。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)大鼠高級(jí)腦功能的重要實(shí)驗(yàn)。正常情況下，大鼠多傾向于沿著曠場(chǎng)的邊緣活動(dòng)，但由于好奇心的驅(qū)使，大鼠又會(huì)向曠場(chǎng)中央進(jìn)行探索;同樣在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠趨向于躲避在閉合臂，但也有向開放臂探索的情況。大鼠在曠場(chǎng)中央停留時(shí)間減少或進(jìn)入開臂次數(shù)減少或在開臂滯留時(shí)間縮短，即表明其出現(xiàn)了抑郁、焦慮等行為學(xué)異常的表現(xiàn)［8］。

1.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open field test)

分別于實(shí)驗(yàn)第3、7、14 d取各組大鼠放置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(規(guī)格為100 cm×100 cm×80 cm)的隔音房內(nèi)，并用弱光照明;待大鼠適應(yīng)環(huán)境5 min后，將其放入曠場(chǎng)中央，記錄15 min內(nèi)每只大鼠在中央停留的時(shí)間(s)、總路程(cm)。

1.3.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(Elevated plus maze text)

待大鼠適應(yīng)環(huán)境5 min后，將其放入“十”字狀的中央并使面向閉合臂，記錄5 min內(nèi)每只大鼠進(jìn)入開放臂和閉合臂的次數(shù)以及停留時(shí)間。所得結(jié)果以每只大鼠在開放臂滯留時(shí)間的百分比(%)和進(jìn)入開放臂次數(shù)的百分比(%)表示。

1.4 痛覺敏感度測(cè)定［9］

分別于束縛應(yīng)激前(作為基線)和束縛應(yīng)激后1、3、7、14 d各時(shí)間點(diǎn)，取空白對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組大鼠，使用Von Frey纖維絲從細(xì)到粗依次對(duì)各大鼠的咬肌進(jìn)行刺激;每一型號(hào)刺激5次，當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)至少3次縮頭、避開、抬腿、發(fā)出聲音等行為時(shí)，即視為有痛覺反應(yīng)，并以該Von Frey纖維絲對(duì)應(yīng)的壓力值作為該動(dòng)物的痛覺閾值。痛覺閾值降低，即說明其痛覺敏感度升高。

1.5 心理應(yīng)激對(duì)GFAP表達(dá)影響的觀察

1.5.1 免疫組化染色檢測(cè)GFAP的表達(dá)水平

上述檢測(cè)結(jié)束后，取各組大鼠分別在10 g/L戊巴比妥鈉過量麻醉(50 mg/kg腹腔注射)下，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)經(jīng)左心室快速灌注，沖凈血液后換用4℃的40 g/L多聚甲醛溶液300 mL進(jìn)行灌注固定;然后取各大鼠的腦干及頸髓，并以閂門平面為中心切取包括頭向4 mm、尾向6 mm的組織塊，放入40 g/L多聚甲醛液中4℃下固定4～6 h后，再置于300 g/L蔗糖液中4℃過夜。取固定后的各組織塊，分別進(jìn)行橫向連續(xù)冰凍切片(厚25 μm)。取各組切片放入0.1 mol/L PBS中置搖床上漂洗3次(每次10 min)后，滴加驢血清封閉10 min;滴加鼠抗GFAP(1∶700)一抗，室溫、慢搖24 h;滴加驢抗鼠 (1∶500)二抗，室溫、慢搖4 h，最后再滴加 AB 液(1∶500)，室溫、慢搖 1 h。以上每個(gè)步驟完成后均用PBS漂洗3次，每次10 min。取上述處理的所有切片，分別進(jìn)行DAB顯色后，脫水、透明，中性樹膠封片;顯微鏡下觀察并用計(jì)算機(jī)輔助成像分析裝置檢測(cè)各組相同部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫陽性率(percent area occupied by immuno-products(%))［6］。

1.5.2 Western-blot檢測(cè)GFAP蛋白的表達(dá)水平

斷頭處死各組大鼠，分別取其三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核，冰上孵育10 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，超聲粉碎(500 W)5 s×5次;10 000 r/min離心5 min，取上清并用BCA蛋白定量法測(cè)定總蛋白濃度。制備12%的分離膠和4%濃縮膠，然后取總蛋白以每孔20 μg上樣進(jìn)行SDS.PAGE電泳(濃縮膠80 V，分離膠120 V)。電泳結(jié)束后，取適當(dāng)大小的凝膠和PVDF膜在50 V電壓下轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果;然后將PVDF膜置于50 g/L去脂奶粉中封閉2 h;依次加入一抗(1∶1000)、二抗(1∶1 000)雜交，室溫下振蕩封閉;化學(xué)發(fā)光顯色，并用Quantity One 4.4軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值之比作為該樣本中GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

圖1 各組大鼠中央停留時(shí)間比較

圖3 各組大鼠在開放臂滯留時(shí)間百分比

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

隨著心理應(yīng)激時(shí)間的延長，大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的兩指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。其中應(yīng)激7、14 d組大鼠的中央停留時(shí)間與空白對(duì)照組相比均顯著降低(P＜0.05)(圖1);而應(yīng)激14 d組大鼠的活動(dòng)總路程與空白對(duì)照組相比明顯降低(P＜0.05)(圖2)。

2.1.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

隨著心理應(yīng)激時(shí)間的延長，大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的兩指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。其中，應(yīng)激14 d組大鼠的開臂滯留時(shí)間百分比與空白對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05)(圖3);應(yīng)激7 d組、14 d組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比與空白對(duì)照組相比均顯著降低(P＜0.05)(圖4)。

圖2 各組大鼠活動(dòng)總路程比較

圖4 各組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比

2.2 機(jī)械性痛閾測(cè)定結(jié)果

Von Frey纖維絲痛閾測(cè)定結(jié)果顯示，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，大鼠咬肌疼痛閾值呈降低趨勢(shì)。其中應(yīng)激7、14 d組大鼠的咬肌痛覺閾值與空白對(duì)照組相比均顯著降低(P＜0.05)(圖5)。

2.3 心理應(yīng)激對(duì)GFAP表達(dá)的影響

2.3.1 免疫組化觀察結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組僅可見少量而散在分布的GFAP陽性細(xì)胞;而應(yīng)激不同時(shí)間后，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均有所上升(圖6)，且隨著應(yīng)激時(shí)間的延長上升越來越明顯;其中應(yīng)激7 d組和應(yīng)激14 d組與空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖7)。

圖5 各組大鼠咬肌疼痛閾值比較

圖6 各組大鼠Vc中GFAP免疫組化染色觀察(a～d:×100，e～h:×200)

圖7 各組GFAP表達(dá)陽性細(xì)胞率比較

2.3.2 Western-blot檢測(cè)結(jié)果

Western-blot結(jié)果顯示，心理應(yīng)激后GFAP蛋白的表達(dá)量在應(yīng)激7 d和14 d組中有所升高，分別與空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖8)。

圖8 各組Vc中GFAP的相對(duì)灰度值比較

2.4 疼痛閾值與GFAP活化水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，大鼠咬肌的疼痛閾值與 Vc內(nèi)GFAP免疫組化染色陽性率以及GFAP western-blot相對(duì)灰度值均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)(表1)。

表1 疼痛閾值與GFAP活化水平的相關(guān)性分析

3 討論

束縛應(yīng)激是一種能引起典型非特異應(yīng)激表現(xiàn)的方法，該方法不僅可通過限制動(dòng)物的活動(dòng)自由而使之產(chǎn)生應(yīng)激，同時(shí)還能將應(yīng)激過程對(duì)軀體的創(chuàng)傷性減小到最低［10］。因此，為避免創(chuàng)傷性應(yīng)激，本實(shí)驗(yàn)采用束縛應(yīng)激的方法建立心理應(yīng)激動(dòng)物模型。行為學(xué)測(cè)試顯示，大鼠受到束縛應(yīng)激之后，在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間、總路程以及進(jìn)入高架十字開臂的次數(shù)和停留時(shí)間等均隨應(yīng)激時(shí)間的延長而呈下降趨勢(shì)，表明大鼠出現(xiàn)了顯著的焦慮抑郁樣負(fù)性情緒;并提示模型建立成功。

心理應(yīng)激是機(jī)體在某種環(huán)境刺激作用下，由于客觀要求和應(yīng)對(duì)能力不平衡所產(chǎn)生的一種緊張性反應(yīng)。當(dāng)今社會(huì)，面對(duì)日趨復(fù)雜和激烈的社會(huì)競爭，人們往往容易產(chǎn)生心理應(yīng)激，而心理應(yīng)激又與頜面部疼痛，尤其是口頜肌的疼痛有較大相關(guān)性［1，9］。Diniz等對(duì)55所中學(xué)即將高考的學(xué)生進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約有50.9%的人出現(xiàn)顳頜關(guān)節(jié)彈響、頜面部疼痛等與顳頜關(guān)節(jié)功能紊亂病相關(guān)的癥狀［2］。另有研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激還可引起口頜肌肌電活動(dòng)增加、肌緊張度升高、肌疼痛敏感度增強(qiáng)等［11］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用慢性束縛的方法成功建立了大鼠心理應(yīng)激模型，并觀察到，應(yīng)激7 d和14 d組大鼠咬肌機(jī)械性痛閾值明顯下降(疼痛敏感度明顯升高)，與本課題組前期的研究結(jié)果一致［3］。

三叉神經(jīng)脊束核(spinal trigeminal nucleus，STN，包括口側(cè)亞核 Vo、極間亞核 Vi、尾側(cè)亞核Vc)是頜面部信息向中樞傳導(dǎo)的第一門戶［12］，是參與口頜面部傷害性信息傳遞的重要部位。Sara等研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激可使大鼠Vc內(nèi)的磷酸化環(huán)磷酯腺苷(cAMP)反應(yīng)成分結(jié)合蛋白(pCREB)及其下游基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，故Vc被認(rèn)為是心理應(yīng)激引起疼痛的中樞關(guān)鍵部位［13］。有研究證明，舌下注射福爾馬林引起炎性舌頭痛后，在Vc內(nèi)可觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞活化［14］。Kohei等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠咬肌注射完全弗氏佐劑(CFA)后，Vc中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物GFAP表達(dá)量增加［15］。除上述炎性痛外，近年來還有研究證實(shí)，通過結(jié)扎大鼠L5脊神經(jīng)使之產(chǎn)生神經(jīng)病理性痛時(shí)，其脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)明顯活化［16］。上述結(jié)果提示，無論在炎性痛還是神經(jīng)病理性痛情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)明顯的活化，且與痛覺敏感度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也觀察到，大鼠經(jīng)慢性束縛應(yīng)激后，其Vc內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，且呈現(xiàn)出慢性化過程并與咬肌的痛覺敏感度相關(guān)聯(lián)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞活化參與疼痛的維持可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元交互作用(crosstalk)有關(guān)［17］。有研究報(bào)道，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后可釋放各種炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF- α)等［18］，從而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并進(jìn)而使之惡化和維持疼痛。汪偉等［19］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)病理性痛時(shí)，脊髓背角GFAP與c-jun N末端激酶(pJNK)大量共存，小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物CD11b與pp38大量共存，且各自的表達(dá)均具有時(shí)空特異性，即小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷后數(shù)小時(shí)達(dá)到峰值，此后逐漸降低;而星形膠質(zhì)細(xì)胞則在神經(jīng)損傷后數(shù)日至數(shù)周才逐漸活化并持續(xù)表達(dá)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的發(fā)生中起重要作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的維持和惡化階段扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠Vc內(nèi)GFAP的表達(dá)在建模7 d后明顯升高，且至少持續(xù)至2周，與上述結(jié)果相類似;進(jìn)一步說明星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與介導(dǎo)了大鼠咬肌痛敏的持續(xù)存在。

本課題組前期的研究主要集中于心理應(yīng)激后的外周水平，并觀察到大鼠經(jīng)心理應(yīng)激后其下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸興奮性增強(qiáng)［20］;三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)mRNA的表達(dá)水平增加［21］。以上結(jié)果提示，來自初級(jí)傳入的肽能纖維可能在Vc內(nèi)釋放增加并進(jìn)而激活中樞，即外周敏化引起中樞敏化;而在此過程中位于Vc的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能發(fā)揮著重要的作用。

本結(jié)果提示，Vc可能是調(diào)控心理應(yīng)激導(dǎo)致口頜面部疼痛的主要區(qū)域，而且Vc內(nèi)GFAP的活化可能參與了心理應(yīng)激后痛覺過敏的發(fā)生;但星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活或抑制是否能直接影響心理應(yīng)激后痛覺敏感的發(fā)生仍需要進(jìn)一步的研究。

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