桑葉發(fā)酵前后總黃酮、總酚酸含量變化及抗氧化活性研究

1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600； 2.清華大學 工程物理系，北京 100084

桑葉發(fā)酵前后總黃酮、總酚酸含量變化及抗氧化活性研究

王吉成1,2劉軒2唐勁天2翟延君1*

1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600； 2.清華大學 工程物理系，北京 100084

目的:比較桑葉70%乙醇提取物液體發(fā)酵前后的抗氧化活性，并考察發(fā)酵前后總黃酮、總酚酸含量的變化。方法:利用冠突散囊菌在桑葉70%乙醇提取物的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，將得到的發(fā)酵液和未發(fā)酵的桑葉70%乙醇提取物以抗壞血酸和EDTA為陽性對照，針對指定指標(DPPH、ABTS、FRAP、OH·、螯合能力)進行體外抗氧化活性試驗；并對發(fā)酵前后總黃酮、總酚酸含量進行測定。結(jié)果:未發(fā)酵桑葉70%乙醇提取物的抗氧化活性整體優(yōu)于液體發(fā)酵后的抗氧化活性。其中未發(fā)酵桑葉70%乙醇提取物對DPPH、ABTS、螯合能力的IC50值分別為：4.69mg·ml-1、2.03mg·ml-1、20.89mg·ml-1，而液體發(fā)酵后的桑葉70%乙醇提取物三者的IC50值分別為：12.42mg·ml-1、2.65mg·ml-1、14.81mg·ml-1；同時含量測定結(jié)果顯示，發(fā)酵后桑葉中總多酚含量較發(fā)酵前明顯下降，而發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量卻明顯高于發(fā)酵前總黃酮含量。其中發(fā)酵前桑葉中總黃酮、總酚酸含量分別為4.39mg·ml-1、3.95mg·ml-1，而發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量高達8.53mg·g-1，總酚酸卻下降為1.24mg·g-1。結(jié)論:桑葉70%乙醇提取物液體發(fā)酵前后體外均具有一定的抗氧化活性，但發(fā)酵前抗氧化作用較明顯。此外通過微生物轉(zhuǎn)化，顯著性提高桑葉中總黃酮含量的同時，卻降低了桑葉中總酚酸含量，因此可以推測，桑葉中起到抗氧化作用的主要成分并非是黃酮類化合物，而是非黃酮類的多酚類成分。

桑葉；冠突散囊菌；液體發(fā)酵；抗氧化；總黃酮；總多酚

冠突散囊菌，又稱“金花”菌，是茯磚茶的優(yōu)勢菌種。它可以降低茶葉原料的澀味，同時自身帶來的菌花香及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的色素都增強了茶湯的品質(zhì)[1]。在生產(chǎn)、儲存和治療評價中，將冠突散囊菌的質(zhì)量和數(shù)量作為判斷茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的標志。

桑葉為?？浦参颩orusalbaL.的干燥葉。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品，歷代本草均有收載。其性寒，味甘、苦，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目之功效，是常用中藥之一[2]。桑葉中含有很多活性物質(zhì)，如多酚類、黃酮類、生物堿類、多糖類、苯丙素類及甾醇類化合物[3]。近年來，有關(guān)桑葉的抗氧化活性的研究報道較多，但利用真菌液體發(fā)酵桑葉，并對其某一類活性物質(zhì)含量以及抗氧化能力的研究未見報道。本試驗利用從茯磚茶中分離得到的冠突散囊菌，對桑葉進行單一菌種的液體發(fā)酵，意在考察液體發(fā)酵對桑葉中抗氧化成分含量及能力的影響。

1 材料

1.1 原料與試劑 桑葉產(chǎn)自安徽(生產(chǎn)批號20130701)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定為?？浦参锷orusabaL.的干燥葉；冠突散囊菌由清華大學工程物理系粒子技術(shù)與輻射成像教育部重點實驗室分離獲得并鑒定[4]；馬鈴薯葡萄糖瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蘆丁購自成都曼斯特生物科技公司(純度≥98%)； 沒食子酸購自成中國食品藥品檢定研究院(純度≥98%)；2,2’-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)購自Amresco公司；二苯代苦味?；?DPPH)購自Alfa Aesar 公司；菲洛嗪購自A ALDRICH公司；水楊酸購自西隴化工股份有限公司；抗壞血酸購自共廣州化學試劑廠；其余試劑均為分析純；1.2 儀器與設(shè)備 VARIOSKAN FLASH型全波長掃描多功能讀數(shù)儀為美國 Thermo Scientific 公司的產(chǎn)品；KQ 5200 DE型超聲儀為昆山市超聲儀器有限公司的產(chǎn)品；EYEL4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為日本EYELA公司的產(chǎn)品；Venticell烘箱為德國MMM公司的產(chǎn)品；DZE-6050型真空干燥箱為北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；SVE-4A1型垂直流超凈工作臺為新加坡ESCO公司的產(chǎn)品；THZ-D型臺式恒溫振蕩器為蘇州培英實驗設(shè)備有限公司的產(chǎn)品；AL204-IC型電子天平為梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司的產(chǎn)品；SHZ-CB型循環(huán)水式真空泵為鞏義市英峪予華儀器廠的產(chǎn)品；pH計為梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司的產(chǎn)品；微量移液器為美國Thermo公司的產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為德國MMM公司的產(chǎn)品；NANOpure超純水系統(tǒng)為美國Barnstead公司的產(chǎn)品；3-18K型超速離心機為美國Sigama公司的產(chǎn)品。

2 發(fā)酵處理方法

2.1 冠突散囊菌孢子懸液制備 參照本實驗室前期研究茯磚茶中冠突散囊菌的分離純化方法[4]，將得到純化后的冠突散囊菌在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待4d后平板長滿菌落，在無菌條件下，加5ml無菌水于平板上，用接種環(huán)將黃色閉囊殼刮下，懸浮于無菌水中，再將懸浮液吸入帶有玻璃珠和95ml無菌水的三角瓶內(nèi)，150r·min-1振搖30min，制成均勻的孢子懸液。調(diào)整孢子濃度為(5.0～6.0)×108cfu·mL-1。

2.2 桑葉液體培養(yǎng)基的制備 稱取8g干燥桑葉于500ml錐形瓶內(nèi)，加500ml 70%乙醇超聲提取2次，每次45min。立即減壓過濾，殘渣用少量70%乙醇洗3次，合并濾液。濃縮至無醇味，加蒸餾水定容至1L。以鄧放明[5]篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基配方作為參考，確定培養(yǎng)基成分為：含0.8%(m∶v)桑葉的浸提液，pH=5.5。配制好的培養(yǎng)基在120℃下高壓蒸汽滅菌30min。

2.3 接種與發(fā)酵培養(yǎng) 將制備好的冠突散囊菌孢子懸液在無菌條件下接種到桑葉液體培養(yǎng)基中，使得接種量均為0.16(g∶ml)。以鄧放明[5]篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基配方作為參考，發(fā)酵條件為30 ℃，120 r·min-1條件下培養(yǎng)7d。

3 桑葉中總黃酮、總酚酸含量測定

3.1 桑葉中總黃酮、總酚酸溶液的制備

3.1.1 未發(fā)酵桑葉中總黃酮、總酚酸溶液的制備 稱取8g桑葉于500ml錐形瓶，加70%乙醇500ml超聲提取2次，每次45min。立即減壓過濾，殘渣用少量70%乙醇洗3次，合并濾液，濃縮得浸膏。精密稱取該浸膏0.2g(生藥量)，用3ml、70%乙醇超聲提取20min，重復操作2次，最后用70%乙醇定容到10ml。制得0.02g·mL-1(生藥濃度)的未發(fā)酵桑葉供試品溶液。

3.1.2 液體發(fā)酵7 d桑葉中總黃酮、總酚酸溶液的制備 將發(fā)酵7d的桑葉液體培養(yǎng)基抽濾，濃縮得浸膏。參照3.1.1方法中制備得到0.02 g·mL-1液體發(fā)酵7d桑葉供試品溶液。

3.2 總多酚含量測定

3.2.1 標準曲線繪制 參考文獻[6]，采用Folin-Ciocalteu比色法，稍作修改。吸取質(zhì)量濃度為0.01～0.1mg·mL-1沒食子酸標準溶液20μl于96孔板中，加入10%福林酚水溶液100μl，混勻，反應(yīng)5min，加入7.5%碳酸鈉溶液80μl，混勻，室溫下反應(yīng)60min，在765nm處測定吸光度值，繪制標準曲線：Y=5.8477X+0.0152，R2=0.9988。

3.2.2 樣品總多酚含量測定 將發(fā)酵前后樣品溶液按著3.2.1方法顯色，測定吸光度。根據(jù)標準曲線方程計算樣品中總多酚含量，結(jié)果表示為沒食子酸當量(mg·g-1)。

3.3 黃酮含量測定

3.3.1 標準曲線繪制 參考文獻[7]，采用AlCl3顯色法，略有修改。分別吸取質(zhì)量濃度為0.4mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.01mg·mL-1、0.005mg·mL-1的蘆丁對照品溶液1ml，加2ml 0.1mol·l-1AlCl3和1ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(PH5.2)，搖勻，40℃水浴10min，吸取200 μl反應(yīng)液于96孔板中，在405nm處測定吸光度值。繪制標準曲線：Y=3.9748X-0.0032，R2=0.9996。

3.3.2 樣品總黃酮含量測定 將發(fā)酵前后樣品溶液按著3.3.1方法顯色，測定吸光度。根據(jù)標準曲線方程計算樣品中總黃酮含量，結(jié)果表示為蘆丁當量(mg·g-1)。

4 體外抗氧化活性測定

供試品溶液制備：精密稱取各樣品0.5g(生藥量)，用2ml 70%乙醇溶解， 超聲提取2次，最后用適量70%乙醇定容至5ml容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為100mg·ml-1樣品溶液。用70%乙醇依次稀釋，得到質(zhì)量濃度為：20mg·ml-1、12.5mg·ml-1、5mg·ml-1、4mg·ml-1、2mg·ml-1、0.8mg·ml-1、0.16mg·ml-1、0.032mg·ml-1的供試品溶液。

4.1 對自由基清除能力的測定

4.1.1 DPPH自由基清除試驗 采用Tagashira and Ohtake(1998)的方法略有改動。配置DPPH自由基測定液：稱取7.88mg DPPH自由基，用無水乙醇溶解并定容與100 ml容量瓶中，配置成2×10-3mol·l-1的DPPH自由基溶液，于0～4℃避光保存，備用。測定：分別吸取各供試品溶液50μl于96孔板中，加入150μl DPPH自由基測定液，迅速混勻，37℃恒溫反應(yīng)30min，在510nm處測定吸光度。樣品空白對照以無水乙醇代替DPPH自由基測定液，其余步驟與樣品相同；陰性對照以70%乙醇代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。所有的測量值均做3個復孔取其平均值。Vc作為陽性對照。樣品的抗氧化程度用對DPPH自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越強，反之則弱。計算公式如下：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(A0為陰性對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品空白對照組吸光度。)

4.1.2 ABTS+自由基清除試驗 參考文獻[8]和[9]的方法，并作適當修改。配制ABTS+自由基儲備液：配制2.45mmol·l-1K2S2O8溶液和7.0mmol·l-1ABTS溶液，二者等體積混合，避光條件下靜置16h，形成ABTS+自由基儲備液。配制ABTS+自由基測定液：將ABTS+自由基儲備液用溶劑稀釋，使其吸光度在734nm波長處達到0.700±0.020。測定：吸取各供試品溶液50μl于96孔板中，加入150μl ABTS+自由基測定液，混勻，室溫下反應(yīng)30min，在734nm處測定吸光度。樣品空白對照以水代替ABTS+自由基測定液，其余步驟與樣品相同；陰性對照以70%乙醇代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。所有的測量值均做3個復孔取其平均值。Vc作為陽性對照。樣品的抗氧化程度用對ABTS+自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越強，反之則弱。樣品對ABTS+自由基的清除率照下面公式計算：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(A0為陰性對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品空白對照組吸光度。)

4.1.3 OH·自由基清除試驗 參考文獻[10]的方法，并作適當修改。制備OH·自由基體系：向5ml比色管中依次移取1.5ml硫酸亞鐵溶液(2mmol·l-1)和1ml雙氧水溶液(6mmol·l-1)，混合均勻后用6mmol·l-1水楊酸溶液定容至刻度，36～37℃恒溫水中反應(yīng)15min后測定A值，即A0值。測定：在該體系中加入1ml各濃度的樣品溶液，36～37℃恒溫水中反應(yīng)15min后測定A值，即為Ax值。樣品空白對照以70%乙醇代替所有反應(yīng)試劑。所有測定值均做3個復孔取平均值。樣品的抗氧化程度用對OH·自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越強，反之則弱。樣品對OH·自由基的清除率照下面公式計算：

清除效率(%)=(A0-Ax)/A0×100%

4.2 對Fe2+還原能力、螯合能力的測定

4.2.1 鐵離子的還原/抗氧化能力(FRAR法) 參照文獻[11]的方法，略做改進。取各供試品溶液0.2ml，分別加入0.2ml磷酸鹽鹽緩沖溶液(pH=6.6，0.2mol·l-1)和0.2ml 1% K3Fe(CN)6溶液。上述混合物于50℃恒溫反應(yīng)20min后，冷卻，加入0.2ml 10%的三氯乙酸水溶液終止反應(yīng)，3000r·min-1離心10min。取上清液0.4ml，加0.4ml蒸餾水，加0.08ml 0.1%FeCl3溶液，混勻，吸取200μl在700nm處測定其吸光度A。樣品空白對照以水代替K3Fe(CN)6，其余步驟與樣品相同；陰性對照以70%乙醇代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。所有的測量值均做3個復孔取其平均值。

4.2.2 Fe2+-螯合能力測定 參照Dinis(1994)方法略有改動。取各供試品溶液100μl，加入25μl FeSO4·7H2O(2mmol·l-1)，震蕩混勻后加入25μl Ferrozine試劑(5mmol·l-1)?；旌衔镌谑覝叵抡鹗幓靹颍磻?yīng)10min后于562nm處測定其吸光度值。吸光度越低表示與 Fe2+螯合能力越強。樣品空白對照以水代替Ferrozine試劑，其余步驟與樣品相同；陰性對照以70%乙醇代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。EDTA作為陽性對照。所有的測量值均做3個復孔取其平均值。計算公式如下：

螯合能力(%)：[1-(A1-A2)/A0]×100%

(A0為陰性對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品空白對照組吸光度。)

5 結(jié)果

5.1 發(fā)酵前后桑葉中總多酚、總黃酮含量 發(fā)酵前后桑葉中總多酚、總黃酮含量見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用冠突散囊菌對桑葉進行液體發(fā)酵7天培養(yǎng)，能夠明顯改變桑葉中總多酚及總黃酮含量，其中發(fā)酵前桑葉中總黃酮、總酚酸含量分別為4.39mg·g-1、3.95mg·g-1，而發(fā)酵后變?yōu)?.53mg·g-1、1.24mg·g-1。表明利用真菌對桑葉進行液體發(fā)酵，能夠明顯改變其原有的化學成分種類與含量。

5.2 清除DPPH自由基作用 清除DPPH自由基能力的測定結(jié)果及IC50分別見圖2和表1。從圖2.中可以看出，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對DPPH自由基均有一定的清除作用，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物清除DPPH自由基的IC50分別為4.69mg·ml-1、12.64mg·ml-1，而陽性對照抗壞血酸IC50為0.028mg·ml-1。表明發(fā)酵后的桑葉70%乙醇粗提物對DPPH自由基的清除能力小于未發(fā)酵桑葉70%乙醇粗提物，且發(fā)酵前后桑葉70%乙醇粗提物對DPPH自由基清除能力遠小于抗壞血酸。

5.3 清除ABTS+自由基作用 ABTS法清除自由基能力的測定結(jié)果及IC50分別見圖3和表1。發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對ABTS+自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物清除ABTS+自由基的IC50分別為2.03mg·ml-1、2.65mg·ml-1，而陽性對照抗壞血酸IC50為0.025mg·ml-1。表明發(fā)酵后的桑葉70%乙醇粗提物對ABTS+自由基的清除能力略小于未發(fā)酵桑葉70%乙醇粗提物，且發(fā)酵前后桑葉70%乙醇粗提物對ABTS+自由基清除能力活性遠小于抗壞血酸。

表1 發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物清除自由基能力

注：DPPH：二苯代苦味?；?；ABTS：2,2’-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽。

5.4 清除OH自由基作用 清除OH自由基能力的測定結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對OH自由基的清除能力均比較低，在實驗濃度為20mg·ml-1時，清除能力才達到20%左右。故發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對OH自由基具有很低的清除能力。

5.5 鐵離子的還原/抗氧化能力(FRAR法) 對鐵離子還原能力的測定結(jié)果見圖4。發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物具有一定的鐵還原能力，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出量效關(guān)系。但兩者的還原能力均明顯低于抗壞血酸。

5.6 螯合能力 發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物的鐵離子螯合能力見圖5和表2。發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物與Fe2+有一定的螯合能力，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物與Fe2+螯合能力的IC50分別為20.89mg·ml-1、14.81mg·ml-1，而陽性對照EDTA-NA2的IC50為0.14mg·ml-1。表明發(fā)酵后桑葉70%乙醇粗提物對Fe2+的螯合能力略高于發(fā)酵前，且發(fā)酵前后桑葉70%乙醇粗提物螯合能力遠小于EDTA-NA2。

表2 發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對Fe2+的螯合能力

6 討論

自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類可以單獨存在的具有高度氧化活性的物質(zhì)，其化學性質(zhì)相當活躍[12]。過量的自由基誘發(fā)機體氧化反應(yīng)，可損害機體的組織和細胞，進而導致衰老[13-14]。植物中多酚、黃酮等活性物質(zhì)能夠清除過剩的自由基，具有一定的抗氧化活性。

本次研究發(fā)現(xiàn)，利用冠突散囊菌對桑葉進行液體發(fā)酵，能夠明顯增加其總黃酮含量，但同時也顯著性降低了桑葉中總多酚含量。同時結(jié)合體外抗氧化活性試驗，可知發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對DPPH、ABTS+自由基具有一定的清除能力，對鐵離子也具有一定的還原能力，而對OH自由基的清除能力較差，且發(fā)酵后的桑葉70%乙醇提取物對自由基清除能力及鐵還原能力均較發(fā)酵前有所降低，暗示桑葉中發(fā)揮主要抗氧化作用的活性物質(zhì)是酚類物質(zhì)多非黃酮類的。但對于與Fe2+的螯合能力而言，發(fā)酵后桑葉70%乙醇提取物活性要略高于發(fā)酵前，也許是由于其抗氧化機制的不同，具體原因有待后續(xù)實驗的進一步研究。

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Antioxidantactivitiesanddeterminationoftotalflavonoidsandtotalphenolicsinthefermentationandnon-fermentationproductsinMulberryleaf

WANG Ji-cheng1,2，LIU Xuan2，TANG Jin-tian2，ZHAI Yan-jun1*

1.College of pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China; 2.Department of Engineering Physics,Tsinghua University,Beijing 100084,China

ObjectiveTo investigate in vitro antioxidant activities of 70% ethanol extract from mulberry leaves between liquid fermentation and non-fermentation, as well as determine the total phenolics and flavonoid contents in them.MethodsThe activated eurotium cristatum were inoculated into the liquid medium that it was 70% ethanol extract from mulberry leaves and evaluated the antioxidant activities of its total extract(70% ethanol).With ascorbic acid and EDTA as positive controls,several in vitro experiments were conducted including DPPH assay,ABTS assay, OH radicals assay,ferric-reducing power(FRAP)assay and ion-chelating assay.At the same time,the contents of the total phenolics and flavonoid were determined before and after fermentation.ResultsThe 70% ethanol extract of non-fermented mulberry leaves showed stronger antioxidant activities than the fermented one.For example,the total extract of the non-fermented had capacities of scavenging DPPH 、ABTS+radicals and ion-chelating with IC50 values of 4.69,2.03,20.89mg·ml-1, respectively. Compared with the non-fermented, the fermented one had the three abilities with IC50 values of 12.42,2.65,14.81mg·ml-1,respectively. In the extract from the fermented mulberry leaves,the total phenolic content was significantly lower than the non-fermented one, while the total flavonoids content was increased more than 2-fold.Such as the total flavonoids and the phenolic contents of the non-fermented one were 4.39 and 3.95mg·ml-1,respectively ,which the fermented one were 8.53 and 1.24mg·g-1.ConclusionThe 70% ethanol extracts,whether fermented or non-fermented, show antioxidant activities .However, the antioxidant activity of the non-fermented mulberry leaves is stronger than the fermented one.Base on the increase of the total flavonoid and the decline of the total phenolics,we conclude that the principal active components are the phenolics, but not flavonoids.

Mulberry leaf;Eurotium cristatum;Liquid fermentation;Antioxidant activities;total flavonoids;total phenolic

翟延君,女，博士，教授，主要從事中藥品質(zhì)評價與鑒定方向研究。E-mail:lnzyzyj@sohu.com

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1007-8517(2014)23-0015-04

2014.09.02)