粗枝云杉幼林落針病的生理生化特性1)

楊春琳 許秀蘭 黃曉麗 劉應(yīng)高

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

徐明慶

(攀枝花市東區(qū)林業(yè)局)

劉 韓

(四川省甘孜州林業(yè)科學(xué)研究所)

粗枝云杉(Picea asperata)又名云杉、茂縣云杉、大果云杉以及刺杉等，其適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒耐旱，是我國特有樹種，也是我國西南林區(qū)常見的常綠針葉林樹種。粗枝云杉天然林分布在北緯30°00'～35°50'，東經(jīng) 101°～107°，常與多種常綠針葉樹種混生或以單種成林。隨著云杉人工林的大面積推廣與栽植，其所承受的環(huán)境干擾也日趨嚴(yán)重，主要病害有落針病[1－3]、葉銹病[4－5]、葉疫病[6]等，特別是云杉落針病，在四川甘孜州、阿壩州、綿陽以及甘肅[7－12]等地區(qū)尤為嚴(yán)重，已成為高山地區(qū)云杉幼齡林常見的葉部病害，而病原菌對不同葉齡均有侵染作用。就此，本研究以粗枝云杉為研究目標(biāo)，測定并分析其各生理生化指標(biāo)，以期探明發(fā)病云杉的生化變化規(guī)律，為病害有效控制等提供參考依據(jù)。

1 研究地概況

四川省瀘定縣馬廠梁林場為研究地點。該地位于川西地區(qū)，青藏高原東緣，101°46'～102°25'E，29°54'～30°10'N。因其山高、坡陡、谷深，氣候垂直變化較大，海拔2500～3000 m的年均氣溫為8.5℃;海拔1800～2500 m的年均氣溫為11.5℃;海拔1300～1800 m的年均氣溫為14.5℃。山上中部，夏季多雷陣雨，冬季霜雪期可達(dá)4～6個月。年均降水625 mm，風(fēng)速可達(dá)17 m/s。土壤厚度為50 cm，均為弱酸性土壤。

2 材料與方法

設(shè)置2690、2790 m兩個海拔樣地，以發(fā)病普遍、病株與健株集中、純林以及標(biāo)準(zhǔn)木等為主要依據(jù)設(shè)立20 m×20 m的標(biāo)準(zhǔn)地。每樣地以不同病級(表1)分別采集當(dāng)年生針葉，每病級重復(fù)采樣3次，做好標(biāo)記，放入冰桶冷藏，帶回測定。3、5、7、10月份進(jìn)行采樣。病情指數(shù)=(∑(代表值×該級植株數(shù))/(總株數(shù)×嚴(yán)重度最高值))×100%。

表1 云杉落針病分級標(biāo)準(zhǔn)

多酚氧化酶(PPO)酶活測定采用鄰苯二酚顯色法[13－14]、過氧化物酶(POD)酶活測定使用愈創(chuàng)木酚顯色法[15]214－216、過氧化氫酶(CAT)酶活測定使用硫代硫酸鈉滴定法[15]217－219、苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活測定使用苯丙氨酸顯色法[16－17]、葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用光密度差值法[18－19]、丙二醛(MDA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用硫代巴比妥酸顯色法[20－21]，各指標(biāo)測定重復(fù) 3 次。

使用SPSS 20.0和Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。各指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性系數(shù)，同時圖片繪制采用Origin 8.5軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 病情指數(shù)變化

表2顯示，兩海拔云杉病情指數(shù)隨時間呈“升高—下降—升高”趨勢。3—5月份，2790 m的病情指數(shù)明顯高于2690 m，而后兩者差距逐漸減小，到10月份，2690 m略高于2790 m。說明高海拔比低海拔地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。在3—5月份，隨著病原菌不斷侵入，云杉發(fā)病愈加嚴(yán)重，到5月份時達(dá)到最大，之后云杉體內(nèi)防御系統(tǒng)發(fā)揮主導(dǎo)作用，使病害有所緩解。7—10月份，寄主的防御體系未能抵擋住病原菌的侵染，從而使病害得以蔓延和發(fā)展。

表2 粗枝云杉幼林落針病病情指數(shù)

3.2 防御酶活性變化

PPO活性:不同海拔云杉針葉內(nèi)PPO活性變化存在差異，且不同病級針葉間也無規(guī)律可尋，特別是病級為0、Ⅰ的針葉?？傮w來看，2790 m病級為0、Ⅰ的針葉，其PPO活性總體高于2690 m;2690 m病級為Ⅱ、Ⅲ的針葉，其PPO活性則高于2790 m。另外，在侵染后期，病級為Ⅲ的針葉的PPO活性總體高于其他病級的針葉(表3)。

POD活性:由表3可知，不同海拔云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)POD活性越高，且2690 m的POD活性總體高于2790 m。說明POD積極參與了云杉落針病的病害防御過程。而在2690 m處，環(huán)境氣候相對緩和，能提高云杉的適合度，在病害發(fā)生初期能夠較早且有效地啟動抗病反應(yīng)，引起體內(nèi)POD活性升高。

表3 粗枝云杉防御酶活性

CAT活性:不同海拔云杉針葉內(nèi)CAT活性變化各異。在2690 m處，CAT活性變化呈“下降—上升”趨勢;在2790 m處，CAT活性變化則呈“上升—下降”趨勢?？傮w而言，云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)CAT活性也越高，且2790 m處CAT活性稍高于2690 m，但3月份除外(表3)。

PAL活性:不同海拔云杉針葉內(nèi)PAL活性變化存在差異。在2690 m處，不同病級云杉的針葉內(nèi)PAL活性變化不規(guī)律，而2790 m處其PAL活性變化呈“下降—上升”趨勢，且10月份酶活性稍高。同時，云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)的PAL活性也隨之升高。然而，各海拔間的酶活性大小無明顯差異(表 3)。

3.3 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

表4顯示，不同海拔云杉針葉中葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈“下降—上升—下降”走勢(2690 m病級Ⅲ和2790 m病級Ⅰ呈“下降—上升”趨勢)。在5月份，總體上葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，5月可能是病原菌侵染寄主的下限臨界點。在發(fā)病期內(nèi)，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化無規(guī)律，這或許與寄主的抗性有關(guān)。與葉綠素a不同，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5月份最高，不同海拔云杉針葉中葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈“上升—下降”走勢，但病級較輕的，如2690 m的0、Ⅰ級和2790 m的0級，在感病后期其質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所回升。說明發(fā)病期間，葉綠素b積極參與了抗病過程，而葉綠素a則遭到了病原菌的破壞，使前期的質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速減少。不同病級云杉針葉的葉綠素a/b值變化呈“下降—上升”趨勢(2690 m病級為0、Ⅰ和2790 m病級為0的變化呈“下降—上升—下降”趨勢)，且上升后的比值比前期高許多。葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)除2690 mⅡ級外，其變化則呈“上升—下降”趨勢，且后期質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于前期。此外，云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，總體上，高海拔低于低海拔地區(qū)(表5)。

表4 粗枝云杉葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化動態(tài) mg·g－1

表5 粗枝云杉葉綠素(a/b)和葉綠素(a+b)變化動態(tài)

3.4 MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由表6可見，各海拔的MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不同。在2690 m處，不同病級云杉針葉內(nèi)MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈緩慢上升走勢(健康針葉除外)，而2790 m的MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻呈“下降”趨勢。這應(yīng)該是由于云杉存在抗性差異所引起?？傮w來看，2790 m的云杉針葉內(nèi)MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體高于2690 m;云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其針葉內(nèi)MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)也就越高。

3.5 測定指標(biāo)與病情指數(shù)的相關(guān)性

病情指數(shù)與各指標(biāo)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表7):不同海拔中，其PPO、POD和CAT活性與病級指數(shù)之間相關(guān)性無規(guī)律，這或許與植株抗性強(qiáng)弱有關(guān)。PAL活性與病級指數(shù)間呈負(fù)相關(guān)(2690 m處)，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)與之負(fù)相關(guān)(2790 m病級為0的除外)，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)與之正相關(guān)(海拔越高相關(guān)性越強(qiáng))。另外，葉綠素(a/b)變化與病情指數(shù)間呈負(fù)相關(guān)，且2790 m處云杉發(fā)病越嚴(yán)重，其相關(guān)性越高(特別是病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉)，而葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與病級指數(shù)中度正相關(guān)(2790 m)。MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與病情指數(shù)間相關(guān)性因海拔不同存在差異，2690 m處為負(fù)相關(guān)(健康針葉除外)，2790 m處為正相關(guān)。

表6 粗枝云杉MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同海拔各指標(biāo)間相關(guān)性分析表明(表8):各防御酶系間相關(guān)性無規(guī)律，特別是PPO與POD活性之間，而有一定相關(guān)性的指標(biāo)，一般相關(guān)系數(shù)不高，多數(shù)存在于病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉中，且不同海拔間也存在差異。在2690 m處，病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉中，PPO與CAT活性間中度正相關(guān)，POD與PAL活性間負(fù)相關(guān)(病級為Ⅲ的極顯著負(fù)相關(guān))。而葉綠素a與葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)間均負(fù)相關(guān)(病級為0、Ⅱ的顯著負(fù)相關(guān))，葉綠素a與MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)間中度正相關(guān)(在病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉中)，而葉綠素b與之相反;在2790 m處，POD與CAT活性間呈中度負(fù)相關(guān)，與葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)間也呈中度負(fù)相關(guān)(病級為Ⅱ、Ⅲ的云杉針葉)。另外，葉綠素a與葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)間負(fù)相關(guān)(病級為Ⅰ的顯著負(fù)相關(guān)，但病級為0的無相關(guān)性)。不論同海拔，葉綠素(a/b)與各指標(biāo)間相關(guān)性多數(shù)較低，且無規(guī)律，同時2690 m處，葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其他指標(biāo)間也有類似結(jié)果。在2790 m處，葉綠素(a+b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與PAL活性中度負(fù)相關(guān)，與MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)中度正相關(guān)。

表7 粗枝云杉各測定指標(biāo)與病級指數(shù)間的相關(guān)性

表8 粗枝云杉各測定指標(biāo)間的相關(guān)性

續(xù)(表8)

4 結(jié)論與討論

試驗前期調(diào)查發(fā)現(xiàn):不同海拔區(qū)域，粗枝云杉發(fā)病程度不同，2590～2700 m，平均發(fā)病率為80.15%，平均病情指數(shù)為 38.26;2700～2900 m，96.55%(50.68);2900～3110 m，97.58%(66.93)。就調(diào)查結(jié)果來看，高海拔比低海拔地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。此外，病原菌一般在5—9月份對云杉進(jìn)行侵染[22]，然而在馬廠梁林場，3月份以前，環(huán)境晝夜溫度多處于冰點以下，這限制了環(huán)境中多數(shù)生物的活動。但從3月初開始，環(huán)境溫度迅速回暖，去年生針葉逐漸脫落并長出子囊果進(jìn)行有性生殖，子囊果漸漸成熟并釋放子囊孢子侵染當(dāng)年生針葉，病原菌的侵染最長可持續(xù)至9月份。

PPO、POD和CAT等酶類是植物體內(nèi)抵抗外界干擾的主要防御酶系[23－25]，而 PAL 在次級抗病產(chǎn)物合成方面有一定作用[26－27]。一般植物在受到外界干擾時(如病原菌侵染、植食性動物的啃食以及其他環(huán)境脅迫等)，體內(nèi)會迅速積累活性氧成分[28]，如不及時代謝清除，會影響植株生長甚至使其死亡。試驗結(jié)果表明，各防御酶系間協(xié)同作用不強(qiáng)，幾乎每種酶對病原菌的侵染僅單獨起作用(主要為POD、CAT和PAL)，這不利于體內(nèi)活性氧成分的有效清除，而類似研究發(fā)現(xiàn)，在紫果云杉(P.purpurea)、青杄(P.wilsonii)、川西云杉(P.alfouriana)、青海云杉(P.crassifolia)和粗枝云杉中，粗枝云杉抗落針病能力最弱[29]，而試驗從防御酶系間的相互關(guān)系這一角度給予了解釋。MDA作為膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物(活性氧成分引起膜脂過氧化作用)[30]，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可作為膜脂過氧化水平和生物膜損傷程度的指標(biāo)[31－32]。本試驗中，2690 m 處，不同病級云杉針葉中MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈緩慢增加趨勢(健康針葉除外)，而在2790 m處則剛好相反。說明低海拔地區(qū)植物針葉膜脂過氧化作用較嚴(yán)重，高海拔云杉雖然發(fā)病較嚴(yán)重，但機(jī)體具有較高抗病性，因此能夠較有效的清除體內(nèi)一定量的MDA，這也說明植株在逆境中更能誘導(dǎo)抗性的形成。然而，馬廠梁云杉生長并不樂觀，發(fā)病嚴(yán)重的，其2年及以上生針葉甚至1年生針葉大多脫落，樹枝僅剩半年生針葉或芽苞。

葉綠素是植物的光合器官，包括葉綠素a和葉綠素b。當(dāng)植株遭到侵染后，會影響葉綠素的合成，導(dǎo)致葉片退綠或黃化等[33]。試驗發(fā)現(xiàn)，葉綠素a與葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈“此消彼長”，即葉綠素a先降后升，而葉綠素b先升后降。說明機(jī)體通過協(xié)調(diào)兩者，以彌補(bǔ)葉綠素的損失，使其保持穩(wěn)定水平。侵染期，在病原物的刺激下，機(jī)體迅速合成葉綠素b，彌補(bǔ)葉綠素a的損失，使葉綠素含量超過原有水平，而后期，隨著病害加劇，葉綠素a的增加量不足以彌補(bǔ)葉綠素b的損失量，致使葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速降低至較低水平，從而影響葉片光合作用，使其逐漸喪失光合力，直至枯死凋落。另有研究發(fā)現(xiàn)，植物組織中葉綠素(a/b)值變化在選育抗性品種方面具有一定意義[34]。本試驗中，發(fā)病嚴(yán)重的云杉針葉內(nèi)葉綠素(a/b)值變化呈“下降—上升”趨勢(2690 m病級為Ⅱ、Ⅲ和2790 m病級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的針葉)，即3—5月份，其比值迅速減少至最低，5—10月份，急劇上升為起初(3月份)的4～10倍，而發(fā)病較低(2690 m病級為Ⅰ的針葉)和健康植株的葉綠素(a/b)值變化呈“下降—上升—下降”趨勢，其變化幅度不大，基本在較小范圍內(nèi)上下波動。因此，在粗枝云杉的抗病選育中，葉綠素(a/b)值變化具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]妥桂香.云杉落針病病菌侵染后雪嶺云杉葉片內(nèi)保護(hù)酶活性的變化[J].農(nóng)村科技，2011(10):31－32.

[2]高興喜.涼水自然保護(hù)區(qū)云杉死亡原因初步研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2001.

[3]薛定剛，劉江林.云杉落針病空間分布型及抽樣技術(shù)的研究[J].林業(yè)科技，2005，30(6):21－23.

[4]郭廷舉，杜亞琴，郭思琪，等.紅皮云杉葉銹病病原菌的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，1990，3(5):533－535，540.

[5]曹秀文.粗枝云杉、青海云杉葉銹病病原及轉(zhuǎn)主寄主研究[J].中南林學(xué)院學(xué)報，2000，20(2):78－80.

[6]任瑋.云杉葉疫病的研究[J].西南林學(xué)院學(xué)報，1990，10(2):176－179.

[7]馬俊，唐金權(quán)，王敬.阿壩縣云杉落針病防治效果初探[J].四川林業(yè)科技，2012，33(4):67－68，46.

[8]樊萬韜.對云杉落針病的觀察[J].四川林業(yè)科技，1982(4):36－38.

[9]彭東，劉永琴.云杉落針病的發(fā)生及防治[J].植物醫(yī)生，2009，22(6):37.

[10]劉東漢.云杉落針病與主要因子的相關(guān)性分析[J].林業(yè)資源管理，2001，1(1):55－58.

[11]駱洪元.云杉落針病化學(xué)防治試驗研究[J].甘肅林業(yè)科技，2001，26(2):59－62.

[12]曾效先.營林措施防治云杉落針病研究[J].甘肅林業(yè)科技，1998(3):49－52.

[13]李慧慧，薛志輝，李超，等.雞腿菇多酚氧化酶的特性研究[J].食品工業(yè)，2013，34(5):123－125.

[14]江萍，孫向?qū)?華北落葉松酶活性及抗逆性機(jī)理研究[J].山西林業(yè)科技，2004(1):11－13.

[15]高俊鳳.植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社，2006:217－219.

[16]金慶超，葉華智，張敏.苯丙氨酸解氨酶活性與玉米對紋枯病抗性的關(guān)系[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，21(2):116－118.

[17]謝世勇，盧同，李本金，等.苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶與甘薯抗青枯病的關(guān)系[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，18(4):236－238.

[18]盧曉萍，楊丙賢，徐嬋娟，等.3種小檗科植物葉片SPAD值與葉綠素的相關(guān)性及通徑分析[J].浙江大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2013，39(3):261－266.

[19]朱蓮，劉應(yīng)高，李賢偉.老鷹茶白粉病罹病植株的生理生化研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2007，22(增刊):266－270.

[20]王璟，周慧，邢小萍，等.不同抗黑胚病小麥品種接菌后丙二醛和總酚含量及PPO活性的變化[J].河南科學(xué)，2007，25(3):423－426.

[21]孫正祥，王豐，周燚.內(nèi)生菌XG－1對西瓜枯萎病誘導(dǎo)抗性的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42(3):71－75.

[22]孫國忠，楊慶和，趙謙，等.云杉落針病流行規(guī)律的研究[J].四川林業(yè)科技，1998:19(1):19－24.

[23]喻方圓，徐錫增.植物逆境生理研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究，2003，16(5):6－11.

[24]何利，唐翠明，戴凡煒，等.防御酶與植物抗青枯病關(guān)系研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40(12):101－103.

[25]吳樣孫，陳一壯，蒙信滿，等.水稻紋枯病抗性反應(yīng)中主要防御酶的活性變化[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24(5):327－330.

[26]張淑珍，徐鵬飛，吳俊江，等.大豆疫霉根腐病菌毒素處理抗感不同大豆品種后苯丙氨酸解氨酶活性的變化[J].作物雜志，2008(1):47－49.

[27]畢詠梅，歐陽光察.稻瘟病菌誘導(dǎo)物對水稻苯丙烷類途徑酶系和綠原酸的誘導(dǎo)作用[J].植物生理學(xué)通訊，1990(3):18－20.

[28]李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)[M].北京:高等教育出版社，2002:39－42.

[29]劉錦乾.5種云杉對云杉落針病的抗性測定[J].甘肅林業(yè)科技，2000，25(1):39－42.

[30]張永虎，陳雪，于海峰，等.向日葵芽期抗旱相關(guān)性狀丙二醛含量的SSR分子標(biāo)記分析[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，33(3):25－29.

[31]趙棟，王有科，李杰，等.4種微生物肥對枸杞生長及抗病性的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，47(6):87－92.

[32]馮緒猛，羅時石，胡建偉，等.農(nóng)藥對水稻葉片丙二醛及葉綠素含量的影響[J].核農(nóng)學(xué)報，2003，17(6):481－484，411.

[33]歐志遠(yuǎn).葉綠素含量與植物抗病性的關(guān)系[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13(6):134－135.

[34]馮麗貞.桉樹葉綠素含量與焦枯病抗性的關(guān)系[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，37(4):365－368.