盆栽濱梅扦插苗對NaCl脅迫的響應1)

黃濤 朱泓 王小敏 吳文龍 李維林

(江蘇省中國科學院植物研究所，南京，210014)

我國沿海有豐富的鹽堿土和灘涂資源，是緩解人口增長與耕地減少矛盾的最具潛力的土地后備資源。目前，沿海灘涂開發(fā)中普遍存在物種單一、結構簡單、經(jīng)濟效益低、自我調(diào)控力弱和生態(tài)系統(tǒng)受損退化等問題，研究適合鹽土生長的經(jīng)濟植物，可為高效開發(fā)和可持續(xù)利用沿海灘涂資源，實現(xiàn)沿海經(jīng)濟社會和生態(tài)環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展提供技術支撐。

濱梅(Prunus maritima Marshall)是薔薇科的一種鹽生灌木，是目前發(fā)現(xiàn)的最耐鹽堿的木本果樹。濱梅根系發(fā)達，具有耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿等方面的抗逆性，可用于海岸灘涂修復和沙丘固定，是一種花果兩用的耐鹽新經(jīng)濟樹種。國外的一些研究機構發(fā)現(xiàn)，濱梅能在pH值8.0和0.9%NaCl脅迫下正常生長[1]。扦插繁殖是木本植物栽培過程中最為常用的無性繁殖手段之一，其優(yōu)點在于簡便、快速、經(jīng)濟，同時能夠保持母體植株的所有優(yōu)勢。迄今為止，濱梅無性繁殖技術的研究已取得了一定進展[2－5]，但相對于種子苗的耐鹽性研究[6－8]，無性繁殖植株的耐鹽性研究仍停留在組培水平[9]，扦插苗耐鹽能力研究尚未展開。開展濱梅扦插苗耐鹽能力的研究，對濱梅的推廣具有重要的理論價值。為此，文中對NaCl脅迫下濱梅扦插苗生長和生理響應變化規(guī)律進行了研究，以期為新型耐鹽經(jīng)濟植物的遴選提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

材料:1年生且生長良好的濱梅扦插苗。

儀器:美能達SPAD－501便攜葉綠素儀，Thermo Scientific Orion Star A，Molecular Devices SPECTRA max PLUS 384。

試劑:磷酸緩沖液(pH=7.4)，甲硫氨酸(Met)溶液，核黃素溶液，氮藍四唑溶液，EDTA－Na2溶液，0.2%愈創(chuàng)木酚，H2O2溶液，牛血清白蛋白，90%乙醇，85%磷酸，考馬斯亮藍G－250溶液，Na+測試試劑，連二亞硫酸鈉，1%TTC 溶液，1 mol·L－1硫酸，0.5%硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)。

試驗采用盆栽方式，塑料盆底徑13.5 cm、口徑15 cm、高18 cm，每盆裝入磨細過篩的輕壤質(zhì)干土3 kg。2013年4月初，每盆栽種1年生且生長均勻的濱梅扦插苗1株，先用淡水澆灌，4月中旬待苗木恢復正常生長后，開始換用不同質(zhì)量濃度NaCl溶液澆灌，NaCl溶液的質(zhì)量濃度分別為 0(對照，CK)、1.5、2.9、5.8、8.8、11.7、14.6 g·L－1，每處理重復 3 次，隨機區(qū)組排列。每盆每次澆300 mL NaCl溶液，每隔4 d澆1次，持續(xù)40 d，之后用淡水澆灌，80 d后結束試驗。

生長指標:處理80 d時測定各植株新萌枝長，同時分別取5盆濱梅，測定地上部分、地下部分生物量，經(jīng)殺青、烘干測得干質(zhì)量(于105℃殺青15 min，后在60℃下烘干至恒質(zhì)量)，計算鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、根冠比增幅及含水率。

生理指標:處理40、80 d時分別選擇各處理植株第4～5片正常生長的功能葉測定生理指標，其中超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)采用考馬斯亮藍法測定，Na+濃度采用試劑盒法測定;葉片的葉綠素相對含量用SPAD值表示，采用美能達SPAD－501便攜葉綠素儀在09:00—11:00 測定[10]，重復 3 次，取平均值;根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法測定;土壤pH值測定參照李強等[11]的方法;電導率測定參照李東順等[12]的方法;在處理80 d時用電導法測定植株抗逆性(質(zhì)膜透性)，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定葉片丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度。

植物組織受到逆境傷害時，由于膜的功能受損或結構破壞，而使其透性增大，因此，通過測定組織外滲液相對電導率(RE，C)，說明外滲狀況即植物傷害程度，可判定植物抗逆能力。植物器官在逆境脅迫下，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累表明膜脂損傷的加劇。植物組織中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)是植物生理研究中的重要指標，它代表胞液的濃度及組織代謝的水平，反映出組織生理活性的高低。SOD、POD、CAT都與植物抗逆性密切相關，其機理是減輕活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害。根系是植物抵御鹽脅迫的重要屏障，根系的生長發(fā)育還會影響植物對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而影響地上部莖葉的生長。根系脫氫酶活力反映了根系呼吸作用的強弱，是反映根系活力的重要指標[12]。葉片SPAD值與葉片總葉綠素含量有極顯著的正相關關系，可以很好地反映葉綠素含量，且測定不會破壞植物葉片，不受時間、氣候等條件的限制[10]。

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用 Duncan’s法進行多重比較(P＜0.05)。

含水率=[(鮮質(zhì)量－干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量]×100%。

根冠比=植株地下部干質(zhì)量/植株地上部干質(zhì)量。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對濱梅扦插苗生長的影響

從表1可見，不同質(zhì)量濃度NaCl溶液脅迫下，各處理植株地上部、地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、根冠比以及萌枝長度均表現(xiàn)了不同程度的差異性變化(P＜0.05)，從中可以發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律:在 1.5～2.9 g·L－1的低質(zhì)量濃度NaCl脅迫下，植株地上、地下部分鮮質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量及根冠比均高于對照，地上部分干質(zhì)量與對照相當或略低，萌枝長度略低于對照，說明濱梅在低鹽土壤環(huán)境中會通過根系的補償性生長保持整個植株的良好生長;當NaCl質(zhì)量濃度超過5.8 g·L－1后，植株地上、地下部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、根冠比、萌枝長呈下降趨勢，而且除地下部分鮮質(zhì)量外都顯著低于對照，說明高質(zhì)量濃度NaCl脅迫對濱梅生長有顯著影響;在NaCl鹽脅迫下，濱梅地下部分的鮮、干質(zhì)量均呈現(xiàn)下降趨勢，但是大部分處理的鮮質(zhì)量及所有處理的含水率均高于對照(NaCl處理質(zhì)量濃度 2.9 g·L－1時的含水率異常，可能是試驗中的偶然偏差)，說明鹽脅迫下濱梅根系有通過超常吸水來稀釋根內(nèi)鹽質(zhì)量濃度從而緩解鹽害的能力，這也許是濱梅耐鹽機理的重要表觀現(xiàn)象。

試驗中的外觀觀察結果顯示，1.5～2.9 g·L－1NaCl處理下濱梅長勢正常，甚至部分植株還略好于對照，在5.8 g·L－1NaCl處理下濱梅長勢基本正常，說明濱梅可能是一種喜鹽植物;8.8 g·L－1NaCl處理下，早期濱梅植株生長正常，之后大部分植株逐漸呈輕微失綠癥狀，有少許葉片發(fā)黃、卷曲，并自下而上開始落葉;NaCl質(zhì)量濃度高于 8.8 g·L－1后，從處理開始，大部分植株即逐漸失綠，部分葉片發(fā)黃、卷曲，后期落葉現(xiàn)象嚴重。以上外觀表現(xiàn)顯示，濱梅在1.5～5.8 g·L－1NaCl脅迫下可以正常生長，能短期忍受8.8 g·L－1NaCl脅迫，在更高質(zhì)量濃度鹽脅迫下濱梅不能正常生長。

2.2 NaCl脅迫對濱梅扦插苗生理指標的影響

2.2.1 葉片SPAD值的變化

從表2可見，NaCl處理40 d時，各處理與對照相比，濱梅扦插苗葉片SPAD值沒有顯著差異，表明短時間脅迫對濱梅葉片的葉綠素含量沒有顯著影響;處理80 d 后，鹽質(zhì)量濃度在 8.8 g·L－1以上的葉片SPAD值與對照相比顯著降低，表明長時間高鹽脅迫開始破壞葉綠素合成。

表1 不同質(zhì)量濃度NaCl處理80 d后濱梅扦插苗生長狀況

表2 NaCl脅迫下濱梅葉片SPAD值的變化

2.2.2 細胞膜透性的變化

由表3可知，經(jīng)NaCl處理80 d時，各處理組MDA質(zhì)量摩爾濃度均高于對照，在質(zhì)量濃度為2.9 g·L－1時，MDA質(zhì)量摩爾濃度達到最高，且與對照差異顯著，然后，隨著鹽質(zhì)量濃度的增加而降低，但在質(zhì)量濃度為14.6 g·L－1時，MDA 質(zhì)量摩爾濃度又增加。說明濱梅在較低鹽質(zhì)量濃度下膜脂過氧化反應強烈，但受到高質(zhì)量濃度鹽脅迫時細胞膜受到破壞，MDA質(zhì)量摩爾濃度又繼續(xù)增加。

各質(zhì)量濃度NaCl處理80 d的濱梅葉片中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)變化不大，除經(jīng)11.7 g·L－1質(zhì)量濃度處理的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)最高，且與對照差異顯著外，其他與對照均無顯著差異，說明濱梅葉片組織的細胞代謝及生理活性在鹽質(zhì)量濃度增加時未受到顯著影響。當NaCl脅迫等于或低于8.8 g·L－1時，濱梅葉片的RE，C與對照相比無顯著差異，當質(zhì)量濃度為 11.7 g·L－1時，濱梅葉片的 RE，C增加，與對照相比存在較大差異(表3)，表明濱梅扦插苗葉片具有一定的抗鹽脅迫的能力。

2.2.3 保護酶活性的變化

由表 4 可知，鹽處理 40 d 后，經(jīng) 8.8 g·L－1NaCl質(zhì)量濃度處理的SOD活性與對照相比差異不顯著，在高于8.8 g·L－1NaCl脅迫時的SOD活性顯著高于對照。經(jīng)8.8 g·L－1NaCl處理的POD活性與對照相比無顯著差異，高于8.8 g·L－1時 POD活性顯著高于對照。CAT活性隨著鹽處理質(zhì)量濃度升高與對照相比無顯著變化，但在8.8 g·L－1處理時達到最高，高于8.8 g·L－1后略有下降。經(jīng)鹽處理80 d后，經(jīng)8.8 g·L－1NaCl質(zhì)量濃度處理的SOD活性與對照相比差異不顯著，鹽質(zhì)量濃度高于8.8 g·L－1后與對照相比顯著降低;經(jīng)8.8 g·L－1NaCl質(zhì)量濃度處理的POD活性與對照相比顯著增加，鹽質(zhì)量濃度高于8.8 g·L－1后活性繼續(xù)升高;CAT 活性經(jīng) 8.8 g·L－1NaCl處理后顯著高于對照，鹽質(zhì)量濃度高于8.8 g·L－1后活性均略有下降但仍顯著高于對照。

表3 NaCl脅迫80 d后對濱梅葉片細胞膜透性的影響

2.2.4 根系活力的變化

濱梅扦插苗經(jīng)NaCl處理后，根系活力隨脅迫時間的增長而增強，當 NaCl脅迫低于 11.7 g·L－1時，隨脅迫質(zhì)量濃度的升高根系活力增強(表5)，當NaCl脅迫為 11.7 g·L－1時，根系活力達到最高，為對照的 1.44 倍，但當 NaCl脅迫為 14.6 g·L－1時，根系活力急劇下降。根系是最先感觸鹽脅迫的部位，濱梅根系活力在中低度鹽脅迫下呈現(xiàn)活力增強的現(xiàn)象，說明了濱梅根系具有較強的抵御鹽脅迫逆境的能力。

表4 NaCl脅迫對濱梅葉片保護酶活性的影響

表5 NaCl脅迫對濱梅根系活力的影響

2.2.5 葉片 Na+濃度的變化

不同質(zhì)量濃度NaCl溶液處理后，盆栽土壤中的鹽分變化極其顯著。8.8 g·L－1NaCl溶液處理40、80 d后土壤電導率分別為對照的 4.06、5.95 倍;經(jīng)11.7 g·L－1NaCl溶液處理 40、80 d 后土壤電導率分別為對照的 5.45、6.13 倍。此時，葉片中 Na+濃度的高低最為直接地反映了植株對脅迫抵抗的能力。由表6可見，經(jīng)NaCl溶液處理40 d，葉片Na+濃度均高于對照;經(jīng) 11.7 g·L－1NaCl溶液處理 40 d，葉片 Na+濃度為對照的2.53倍，顯著高于對照。NaCl溶液處理 80 d 后，經(jīng) 2.9～11.7 g·L－1NaCl溶液處理葉片中Na+濃度均顯著提高，但當NaCl溶液達到8.8 g·L－1以上時，葉片中Na+濃度才顯著高于前一個梯度處理樣品，經(jīng) 8.8 g·L－1NaCl溶液處理 80 d后葉片Na+濃度為對照的 1.46 倍，經(jīng) 11.7 g·L－1NaCl溶液處理80 d后葉片Na+濃度為對照的1.57倍，葉片中Na+濃度的增長率顯著低于土壤中鹽分的增長率。

表6 不同質(zhì)量濃度NaCl處理下土壤電導率和濱梅葉片鈉離子濃度變化

3 結論與討論

鹽脅迫下，植物的生物量變化狀況直觀地反映其對不同質(zhì)量濃度鹽處理的響應[13]。本試驗中濱梅扦插苗的生物量隨NaCl處理質(zhì)量濃度升高呈先升后降的趨勢，這與王利民等[7]對濱梅種子苗的研究結果基本一致。葉片SPAD值反映了葉片總葉綠素含量[10]，試驗中在低質(zhì)量濃度鹽處理時濱梅葉片SPAD值與對照相比差異不顯著，在高質(zhì)量濃度鹽處理下則顯著低于對照，這與吳月燕等[14]對杜鵑的研究一致，表明葉綠素的合成受到抑制，濱梅的葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象也體現(xiàn)了這一差異。NaCl脅迫下濱梅葉的SOD、POD、CAT及根系活力均隨鹽處理質(zhì)量濃度增加呈上升趨勢，但在高鹽度處理后有下降趨勢，這與楊國會[15]、李婧男[16]、Kumar等[17]對甘草、沙冬青、桑樹和四倍體刺槐的研究結論相同，表明這些物質(zhì)在受鹽脅迫的植物體內(nèi)累積，能有效遏制活性氧含量的上升，保持細胞內(nèi)活性氧的平衡，避免對膜脂造成傷害，同時，也顯示了適量的Na+能增強鹽生植物的部分生理功能[18]。

在鹽脅迫下，濱梅扦插苗的生物量隨NaCl處理質(zhì)量濃度升高呈先升后降趨勢，但濱梅扦插苗地上部分和地下部分含水率隨著鹽脅迫質(zhì)量濃度的升高而顯著增加的同時，根系含水率的增加速率顯著高于地上部分，且遠高于王利民等[7]研究中對種子苗的報道。該結果表明濱梅扦插苗的根系完整性弱于種子苗，在鹽脅迫下根系為保持植株的正常生長所承受的壓力更大，其緩解鹽脅迫壓力的重要方式是根系通過充分的吸水而稀釋體內(nèi)的鹽離子質(zhì)量濃度。經(jīng)2.9 g·L－1質(zhì)量濃度 NaCl處理的濱梅葉MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照，到經(jīng)5.8 g·L－1質(zhì)量濃度NaCl處理的又開始下降，同時，濱梅葉的SOD、POD 活性經(jīng)5.8 g·L－1質(zhì)量濃度處理的增加明顯，該結果表明，濱梅的耐鹽是許多酶共同作用的結果。同時在鹽脅迫下，正常生長的功能葉片SPAD值在經(jīng)8.8 g·L－1質(zhì)量濃度 NaCl處理 80 d后才顯著降低。Na+濃度隨著鹽脅迫的增強而增加，但增長速率明顯低于土壤鹽分增長率，且在低于8.8 g·L－1質(zhì)量濃度處理下和對照沒有顯著差異，這些結果表明，濱梅葉片中葉綠素的合成和Na+的積累相關。

根據(jù)盆栽條件下不同質(zhì)量濃度NaCl處理后濱梅地上部和地下部生物量、形態(tài)特征及生理指標變化情況可知，NaCl溶液處理 80 d 后，經(jīng) 2.9 g·L－1以下質(zhì)量濃度處理的濱梅地上和地下部分的生物量增加，經(jīng)5.8 g·L－1質(zhì)量濃度處理的生物量開始下降，但與對照相比無顯著差異，經(jīng)高于8.8 g·L－1鹽質(zhì)量濃度處理下，生長受到明顯抑制;經(jīng)8.8 g·L－1質(zhì)量濃度脅迫40d后超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、根系活力均與對照差異不顯著，然后經(jīng)8.8 g·L－1或以上質(zhì)量濃度脅迫80 d后均顯著高或低于對照，此時，葉片SPAD值也開始顯著低于對照。綜合分析認為，濱梅對NaCl脅迫具有良好的抗逆能力，在 1.5～5.8 g·L－1質(zhì)量濃度的脅迫下可以正常生長，能短期忍受 8.8 g·L－1以上鹽質(zhì)量濃度的脅迫。這一結果為進一步研究濱梅耐鹽機理和在沿海灘涂的推廣提供了可靠依據(jù)。

[1]Rieger M.Salt stress resistance of peach and four North American Prunus species[J].Acta Horticulturae，2001，557(7):181－192.

[2]方逵，龔津平，閆道良，等.耐鹽果樹濱梅微繁殖體系的建立[J].南京大學學報:自然科學版，2006，42(5):490－498.

[3]閆道良，王光，方逵，等.濱梅的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學通訊，2006，42(5):921－921.

[4]閆道良，王光，宰學明，等.乙烯調(diào)節(jié)劑對濱梅離體培養(yǎng)生根的影響[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21(6):67－70.

[5]付素靜，周玉珍.濱梅的組織培養(yǎng)技術研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2009，40(8):969－971.

[6]楊靜，陳金林，徐柏森，等.鹽脅迫對美國白蠟和濱梅根系超微結構的影響[J].西南林學院學報，2009，29(5):23－27.

[7]王利民，陳金林，梁珍海，等.盆栽濱梅幼苗對NaCl脅迫的響應[J].南京林業(yè)大學學報:自然科學版，2010，34(3):89－92.

[8]王利民，陳金林，陳菲然，等.鹽分處理對濱梅根際微域營養(yǎng)元素質(zhì)量分數(shù)的影響[J].東北林業(yè)大學學報，2010，38(2):30－32.

[9]閆道良，郭予琦，宰學明，等.不同濃度NaCl對離體培養(yǎng)的濱梅莖段增殖生長和幾種生理指標的影響[J].植物生理學通訊，2008，44(2):273－275.

[10]蘇云松，郭華春，陳伊里.馬鈴薯葉片SPAD值與葉綠素含量及產(chǎn)量的相關性研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2007，20(4):690－693.

[11]李強，文喚成，胡彩榮.土壤pH值的測定國際國內(nèi)方法差異研究[J].土壤，2007，39(3):488－491.

[12]李冬順，楊勁松，周靜.黃淮海平原鹽漬土壤浸提液電導率的測定及其換算[J].土壤通報，1996，27(6):285－287.

[13]閆道良，王光，方逵，等.耐鹽果樹濱梅的引種及開發(fā)利用[J].林業(yè)科技開發(fā)，2006，20(5):67－69.

[14]吳月燕，李波，張燕忠，等.鹽脅迫對杜鵑生理生化與葉綠體亞顯微結構的影響[J].浙江大學學報:農(nóng)業(yè)與生命科學版，2011，37(6):642－648.

[15]楊國會，石德成.NaCl脅迫對甘草葉片相對含水量及保護酶活性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學 2009(12):104－106.

[16]李婧男，劉強，賈志寬，等.鹽脅迫對沙冬青幼苗生長與生理特性的影響[J].植物研究，2009，29(5):553－558.

[17]Kumar S G，Reddy A M，Sudhakar C.NaCl effects on proline metabolism in two high yielding genotypes of mulberry(Morus alba L.)with contrasting salt tolerance[J].Plant Science，2003，165(6):1245－1251.

[18]Subbarao G V，Ito O，Berry W L，et al.Sodium-A functional plant nutrient[J].Critical Reviews in Plant Sciences，2003，22(5):391－416.