利用高速逆流色譜分離純化微小小球藻Chlorella minutissima中的EPA*

榮 輝，林祥志，王龍梅，蘇永全

(1. 廈門(mén)大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén) 361005； 2. 國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門(mén) 361005)

二十碳五烯酸(eicxcosapentanoic acid，EPA) 屬于ω-3系列多不飽合脂肪酸，它是大腦和視神經(jīng)細(xì)胞的重要組成部分，由于極易被氧化形成保護(hù)膜，可以延緩腦、眼神經(jīng)細(xì)胞的衰老[1].EPA在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為前列腺素E3和前列環(huán)素，具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管、加強(qiáng)微循環(huán)作用，因此它對(duì)心血管疾病的治療與預(yù)防也具有重大意義[2-3].許多微藻都有較高的EPA 含量[3]，如硅藻(Nitzschialaevis)[4]、微小小球藻(Chlorellaminutissima)[5]、紫球藻(Porphyridiumcruentum)[6]、三角褐指藻(Phaeodactylumtricomutum)[7]、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)[8]、眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)[9]和單胞藻 (Monodussubterraneus)[10]等都被認(rèn)為是商業(yè)化生產(chǎn)EPA的潛在重要資源.

高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的Ito博士于20世紀(jì)80年代發(fā)明的一種基于液液分配機(jī)理的新型色譜分離純化技術(shù)，它的固定相和流動(dòng)相都是液體，沒(méi)有不可逆吸附，具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快速和大制備量分離等優(yōu)點(diǎn)[11].本研究主要是利用高速逆流色譜技術(shù)分離純化微小小球藻中的EPA，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

微小小球藻：購(gòu)自美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)藻種庫(kù)，編號(hào)為UTEX 2341.

正庚烷、乙腈、乙酸、甲醇、乙醚、硫酸等均為分析純，EPA標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純(Sigma)，液相色譜檢測(cè)用試劑均為色譜純.

高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司，TBE-300B)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(上海通微分析技術(shù)有限公司，ELSD-UM5000)；高效液相色譜儀(日本島津制作所，LC-20A)；脂肪測(cè)定儀(上海新家儀器有限公司，SZF-06A)；發(fā)酵罐(匯和堂生物工程設(shè)計(jì)(上海)有限公司，SY-3000E).

1.2 微小小球藻的發(fā)酵培養(yǎng)及收集

培養(yǎng)基(1 L)：改良的UTEX Bristol Medium (含葡糖糖10 g/L).

發(fā)酵培養(yǎng)條件：溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)時(shí)間96 h，pH值6.8.

將發(fā)酵液在離心力18 000 g，溫度4 ℃下離心15 min，收集沉淀，再經(jīng)真空低溫冷凍干燥得到微小小球藻藻粉.

1.3 微藻油的提取及皂化處理

采用傳統(tǒng)的氯仿-甲醇法[12]從5.0 g微小小球藻藻粉中提取油脂.

稱(chēng)量500 mg微藻油，加入25 mL濃度為0.5 mol/L 的氫氧化鉀溶液在70 ℃水浴下處理1.5 h后，再用硫酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)為20%)調(diào)pH值至3，得到酸性混合液；然后用等體積的乙醚萃取酸性混合液3次，收集乙醚相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，用100 mL溶劑體系為正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇的下相溶解，得到皂化處理后溶液.

1.4 HSCCC溶劑體系的選擇和HSCCC分離

根據(jù)EPA在不同兩相溶劑體系的分配系數(shù)K值來(lái)選擇合適的溶劑體系，K值為EPA在溶劑體系上相與下相峰面積的比值.待測(cè)溶劑體系為不同體積比(5∶3∶5∶1，5∶4∶5∶1，5∶4∶3∶1，5∶4∶1∶1，5∶5∶1∶1)下的乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇溶液.

將皂化處理后溶液進(jìn)行HSCCC分離，所用溶劑體系為乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇，下相為流動(dòng)相，上相為固定相，在一定的轉(zhuǎn)速，溶劑流速、溫度下進(jìn)行分離，進(jìn)樣量為20 mL，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：漂移管溫度70 ℃，氣體流量為2.5 L/min.

1.5 HSCCC分離條件的響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在三因子三水平上對(duì)微小小球藻油脂中EPA的高速逆流色譜提取條件進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)因子和水平如表1.共進(jìn)行17 組實(shí)驗(yàn)，以EPA的純度Y為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用軟件Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行分析.

表1 實(shí)驗(yàn)因子和水平

1.6 HPLC檢測(cè)分析

分離獲得的EPA樣品用甲醇溶解后進(jìn)行HPLC分析，色譜柱為inertsil ODS-3(5 μm×50 mm×4.6 mm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為甲醇：2%的乙酸水溶液(95∶5，V/V)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL.檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：漂移管溫度70 ℃，氣體流量為2.5 L/min.

2 結(jié)果與分析

2.1 藻細(xì)胞的收集及油脂提取

通過(guò)發(fā)酵罐對(duì)微小小球藻進(jìn)行高密度異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，發(fā)酵液經(jīng)離心濃縮后收集藻細(xì)胞，再經(jīng)真空冷凍干燥后稱(chēng)重，生物量達(dá)到10 g/L(以細(xì)胞干重計(jì)).5.0 g藻粉經(jīng)氯仿-甲醇法粗提獲得0.5 g的粗油脂，含油率為10%.

2.2 HSCCC溶劑體系的選擇

由于EPA是親脂性的，根據(jù)曹學(xué)麗的相關(guān)報(bào)道[13]，選取乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇為兩相溶劑體系，EPA在其不同體積比下的K值經(jīng)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2.根據(jù)報(bào)道，適合逆流色譜分離的K值范圍為0.5-2.0[14]，當(dāng)乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇在體積比為5∶4∶1∶1時(shí)，其K值為0.55，因此選擇其為合適的溶劑體系進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn).

表2 EPA在不同體積比溶劑體系下的K值

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Benhnken中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行17 組實(shí)驗(yàn)，其中12 組為分析因子，5 組為零點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到二次多元回歸模型，通過(guò)最小二乘法擬合二次多元方程為：

Y= -514.73-0.26X1+ 112.89X2+0.97X3-0.03X12-22.71X22-6.28 × 10-4X32- 0.31X1X2+ 2.87 × 10-3X1X3+ 0.04X2X3．

表3 Box-Behnken 中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果ANOVA分析及模型的方差分析表

一般來(lái)說(shuō)HSCCC轉(zhuǎn)速越高，流動(dòng)相流速越低，分離溫度越高，固定相的保留率越高，分離效果就越好，但是高轉(zhuǎn)速對(duì)儀器產(chǎn)生較大的磨損、耗能多，低流速雖然可以滿(mǎn)足高固定相保留率的要求，但是洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，且耗費(fèi)大量的流動(dòng)相，而溫度太高則會(huì)造成溶液的黏度降低進(jìn)而影響分離效果[14].

由圖1可看出：EPA純度響應(yīng)面和等高線分析情況.圖1(a)顯示在HSCCC轉(zhuǎn)速固定為900 r/min時(shí)，流動(dòng)相流速和分離溫度對(duì)EPA純度影響的交互作用，隨著流動(dòng)相流速和分離溫度的增加，EPA純度先增加后降低.圖1(b)顯示在流動(dòng)相流速固定為3.0 mL/min時(shí)，HSCCC轉(zhuǎn)速和分離溫度對(duì)EPA純度影響的交互作用，隨著HSCCC轉(zhuǎn)速和分離溫度的增加，EPA純度先增加后降低.圖1(c)顯示在分離溫度固定為25 ℃時(shí)，HSCCC轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速對(duì)EPA純度影響的交互作用，隨著HSCCC轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速的增加，EPA純度先增加后降低.

(a) 流動(dòng)相流速和溫度對(duì)EPA純度影響的交互作用；(b) HSCCC轉(zhuǎn)速和分離溫度對(duì)EPA純度交互作用；(c) HSCCC轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速對(duì)EPA純度影響的交互作用

最終根據(jù)模型分析，HSCCC分離純化EPA的優(yōu)化條件為：轉(zhuǎn)速912.78 r/min，溶劑流速3.12 mL/min，溫度20.93 ℃，在此條件下EPA純度Y預(yù)測(cè)值為99.40%.

2.4 HSCCC分離

將皂化處理后微小小球藻油脂樣品在優(yōu)化條件下進(jìn)行HSCCC分離，實(shí)際實(shí)驗(yàn)采用：轉(zhuǎn)速913 r/min，溶劑流速3.0 mL/min，溫度21 ℃.HSCCC分離色譜圖如圖2所示，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，EPA的出峰時(shí)間約為24 min，收集EPA組分，旋蒸除去有機(jī)溶劑，待進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析.由于皂化過(guò)程中大多脂肪酸以外的油脂組分被除去，最終500 mg微小小球藻粗油脂中分離純化得到75 mg EPA.

t/min

2.5 HPLC檢測(cè)分析

將分離獲得的EPA樣品用甲醇溶解后進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖3所示，利用面積歸一法計(jì)算EPA純度高達(dá)99.44%.

t/min

3 討 論

3.1 EPA來(lái)源

本研究選取了微小小球藻作為EPA的生產(chǎn)來(lái)源，據(jù)報(bào)道其細(xì)胞脂肪酸組成簡(jiǎn)單，EPA占總脂肪酸含量可高達(dá)44.7%[5]，本研究通過(guò)HSCCC分離純化獲得的EPA僅占所提油脂含量的15%，主要是因?yàn)橛椭谠砘^(guò)程中除去了其它脂類(lèi)，剩下的脂肪酸的含量變少.

3.2 EPA的HSCCC分離

隨著對(duì)海洋生物脂肪酸研究的深入以及各種層析、色譜技術(shù)的出現(xiàn)，人們研究了眾多從生物體中提取多不飽和脂肪酸的方法，主要有：溶劑萃取法、低溫結(jié)晶法、尿素包合法、吸附分離法、分子蒸餾法、脂肪酶濃縮法、超臨界CO2提取法、高效液相色譜法、金屬鹽形成法等[15].HSCCC與傳統(tǒng)的分離純化方法相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，但凡可以形成萃取分離體系的對(duì)象原則上都可以用逆流色譜進(jìn)行分離.本研究將高速逆流色譜技術(shù)引用到微小小球藻油脂中EPA的制備分離上，而利用高速逆流色譜技術(shù)分離化合物成功的關(guān)鍵在于兩相溶劑體系的選擇.因?yàn)镋PA是親脂類(lèi)的多不飽和脂肪酸，本研究選用的溶劑體系為正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇，并且比較了EPA在不同體積比下的K值，最終確定合適的溶劑體系為乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇(體積比為5∶4∶1∶1)，并利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了HSCCC分離純化EPA的條件，在此優(yōu)化條件下分離獲得的EPA純度達(dá)到99.44%.

3.3 EPA的檢測(cè)分析

由于EPA無(wú)紫外吸收，而氣相色譜檢測(cè)需要甲酯化處理，且無(wú)法和高速逆流色譜儀的直接連接實(shí)現(xiàn)在線分析，因此本研究使用了蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)EPA進(jìn)行檢測(cè)分析，它不僅可以直接和高速逆流色譜儀在線連接，且可以對(duì)分離的樣品通過(guò)分流閥直接進(jìn)入蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行在線檢測(cè)，無(wú)需衍生.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器還可以直接和液相色譜相連，對(duì)接收到的經(jīng)高速逆流色譜分離的EPA組分進(jìn)行液相色譜純度分析.

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究首次將高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用到微小小球藻油脂中EPA的分離純化上，經(jīng)篩選合適的兩相溶劑體系為乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇(體積比為5∶4∶1∶1).并利用響應(yīng)面分析法對(duì)高速逆流色譜實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到的最佳條件為：流速3.0 mL/min，轉(zhuǎn)速913 r/min，分離溫度21 ℃，在此條件下，500 mg微小小球藻粗油脂中分離純化到純度為99.44%的75 mg EPA.本研究說(shuō)明游離多不飽和脂肪酸可以通過(guò)高速逆流色譜技術(shù)得到較好的分離純化，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持.

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