硝酸纖維膜和丙酮沉淀尿蛋白質(zhì)保存方法的比較

王小蓉，李遜斗，賈露露，高友鶴

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硝酸纖維膜和丙酮沉淀尿蛋白質(zhì)保存方法的比較

王小蓉，李遜斗，賈露露，高友鶴

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005

王小蓉, 李遜斗, 賈露露, 等. 硝酸纖維膜和丙酮沉淀尿蛋白質(zhì)保存方法的比較. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(6): 982?989.Wang XR, Li XD, Jia LL, et al.Comparison of two urinary protein preparation methods: nitrocellulose membrane preservation and acetone precipitation. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 982?989.

硝酸纖維膜法是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的尿液蛋白質(zhì)保存方法，但其與傳統(tǒng)尿液蛋白質(zhì)丙酮沉淀方法的差異有待進(jìn)一步研究。相同尿液分別經(jīng)硝酸纖維膜法和丙酮沉淀法制備尿蛋白質(zhì)，經(jīng)液相串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)，采用譜圖數(shù)定量，研究兩種不同方法的差別。結(jié)果顯示硝酸纖維膜法和丙酮沉淀法鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎相同，鑒定蛋白質(zhì)在譜圖數(shù)的分布上幾乎相同，鑒定蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)變異系數(shù)的分布上也幾乎相同。因此，硝酸纖維膜法處理尿蛋白質(zhì)與丙酮沉淀法基本一致，可以應(yīng)用于大規(guī)模臨床尿液樣本的保存。

尿蛋白質(zhì)保存，硝酸纖維素膜，蛋白質(zhì)組學(xué)，生物樣本保存

生物標(biāo)志物的最重要特征是變化。血液是人體內(nèi)環(huán)境的一部分，由于受穩(wěn)態(tài)機(jī)制的影響不易容納變化，而尿液沒有任何穩(wěn)定的機(jī)制，所以尿液也可能是比血液更好的生物標(biāo)志物來源。尿蛋白質(zhì)是尿液富含信息的重要承擔(dān) 者，然而正因?yàn)槟虻鞍踪|(zhì)承擔(dān)著容納人體變化的重要角色，影響尿蛋白質(zhì)變化的因素也眾多。因此，盡管利用蛋白質(zhì)組學(xué)已成功地找到了一批能夠反映不同疾病變化的具有廣大臨床應(yīng)用前景的候選標(biāo)志物 (群)，但在真正應(yīng)用于臨床之前還需對這些候選標(biāo)志物 (群) 進(jìn)行大規(guī)模的臨床樣本驗(yàn)證。而這無疑對大量保存尿蛋白質(zhì)臨床樣本的技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。

尿液由于具有蛋白質(zhì)濃度稀、體積大、含鹽高和原液中蛋白質(zhì)易降解的特點(diǎn)，不適合直接大規(guī)模的原液保存，需要將尿液蛋白質(zhì)提取出來保存。丙酮沉淀是常用的尿液蛋白質(zhì)提取方法，但需要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，不利于實(shí)驗(yàn)室及臨床的應(yīng)用，而尿蛋白質(zhì)的膜上保存是可行的解決方案之一。將尿液直接快速通過硝酸纖維膜，尿液蛋白質(zhì)被吸附在硝酸纖維膜上，將膜干燥后真空保存。此種方法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)及占用保存空間小，蛋白質(zhì)被吸附在膜上干燥保存阻止了蛋白質(zhì)的降解，非常適合于臨床大量尿液樣本蛋白質(zhì)的保存。

這項(xiàng)研究在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上對尿蛋白質(zhì)的膜上保存技術(shù)和丙酮沉淀保存技術(shù)進(jìn)行了比較，并且推薦了不同技術(shù)適用的條件。

1 材料與方法

1.1 溶液配制

裂解緩沖液 (10 mL)：尿素4.2 g，硫脲1.54 g，Tris 0.05 g，DTT 0.04 g，雙蒸水定容至10 mL。

磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液 (pH 6.0)：12.3 mL 1 mol/L NaHPO與87.7 mL 1 mol/L NaHPO混勻后，再用5 mol/L NaOH調(diào)pH至6.0。

1.2 尿液采集

微量蛋白尿液樣本100 mL，7 200 r/min離心45 min取上清，–80 ℃凍存。

1.3 丙酮沉淀制備尿蛋白質(zhì)

取15 mL尿液上清，置于250 mL離心瓶中，加入45 mL于–20 ℃預(yù)冷的丙酮，置于–20 ℃冰箱中沉淀4 h。4 ℃、12 000 r/min離心25 min，棄上清，室溫晾干沉淀后加入適量裂解緩沖液重溶蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至EP管后于4 ℃下 12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，測蛋白質(zhì)濃度后–80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 硝酸纖維膜保存尿蛋白質(zhì)

1.4.1 制備用于尿蛋白質(zhì)保存的硝酸纖維膜

取尿液上清15 mL，加入7.5 mL磷酸鹽緩沖液，混勻；根據(jù)真空抽濾瓶的面積剪裁合適的濾紙和孔徑0.22 μm硝酸纖維膜 (一般真空抽濾瓶直徑57 mm，其有效過濾面積直徑為 42 mm)；依次將4層濾紙和一層硝酸纖維膜用水潤濕后置于真空抽濾瓶上 (濾紙?jiān)谙?，硝酸纖維膜在上)，連接好真空抽濾裝置；將尿液倒入，開啟真空抽濾裝置，通過調(diào)節(jié)真空泵，使尿液逐滴滴下；取下硝酸纖維膜置56 ℃烤箱烘干后，封到真空包裝袋內(nèi)真空保存。

1.4.2 硝酸纖維膜上尿蛋白質(zhì)洗脫

將硝酸纖維膜裁去未吸附蛋白質(zhì)的邊，保留有效過濾面積；然后將吸附蛋白質(zhì)的硝酸纖維膜裁剪置于2 mL離心管中，依次加入1.7 mL丙酮，250 μL 0.5%碳酸氫銨水溶液后，強(qiáng)烈振搖10 min (vortex)，然后4 ℃放置1 h；12 000 r/min離心15 min，棄上清，室溫放置30 min，晾干；加入300–400 μL裂解緩沖液，吹打后超聲 10 min，重溶蛋白質(zhì)；吸取重溶后的溶液置于新EP管中12 000 r/min離心15 min，取上清，測蛋白質(zhì)濃度，–80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白質(zhì)酶切與LC-MS/MS分析

取100 μg蛋白質(zhì)，按Wisniewski等方法酶切，酶切后肽段用Oasis小柱除鹽。除鹽后肽段上色譜分離 (Waters UPLC)：洗脫時(shí)間 120 min，色譜柱流速0.5 μL/min，洗脫液由流動(dòng)相A (0.1%甲酸+2%乙腈+97.9%水) 和流動(dòng)相B (0.1%甲酸+89.9%乙腈+10%水) 組成，洗脫梯度為5%–40%流動(dòng)相B。反相柱洗脫下的多肽用LTQ-Orbitrap Velos進(jìn)行質(zhì)譜掃描。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為數(shù)據(jù)依賴模式，全掃描/范圍： 300–2 000，一個(gè)全掃描后對豐度最高的20個(gè)離子分別進(jìn)行碎裂和二級掃描，分離寬度：3/，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間：l min。全掃描在Orbitrap中進(jìn)行，母離子分辨率為60 000，整個(gè)掃描過程把/為445.120 025的離子定為內(nèi)標(biāo)隨時(shí)校正質(zhì)量數(shù)偏差；子離子掃描采用離子阱掃描模式，碎裂能量為正常碰撞能量的35%，q值0.25，活化時(shí)間：10 ms。

1.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索

二級質(zhì)譜結(jié)果用Mascot 2.4進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，所用數(shù)據(jù)庫為Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫。檢索條件：胰酶酶切；允許有2個(gè)漏切位點(diǎn)；固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化；母離子質(zhì)量精確度10×10；子離子質(zhì)量精確度0.5 Da。肽段評分 (Ions score or expect cutoff) 設(shè)定為0.05，蛋白質(zhì)假陽性率 (FDR) <1%，且每個(gè)蛋白質(zhì)鑒定2個(gè)不同的肽段以上。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE分析

同一份尿液均勻分成6份，每份15 mL，分別采用硝酸纖維膜法和丙酮沉淀方法處理3份。每份取25 μg尿蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖1)。

圖1 不同方法制備尿蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖

圖1顯示兩種處理尿蛋白質(zhì)方法，從方法重復(fù)性上看，均具有較好的重復(fù)性；從保存尿蛋白質(zhì)條帶來看，均涵蓋了從高到低分子量范圍，主要條帶類似，但不同條帶強(qiáng)度有一些差異。

2.2 兩種方法質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)重復(fù)性比較

分別采用硝酸纖維膜法和丙酮沉淀法處理3份同樣尿液。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，硝酸纖維膜法制備3份尿液分別鑒定到402、424和393個(gè)蛋白質(zhì)，總共鑒定了495個(gè)蛋白質(zhì)，共同鑒定326個(gè)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)鑒定的重復(fù)率 (重復(fù)率=共同鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)/平均鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)×100%)為80.2% (圖2A)；丙酮沉淀法制備3份尿液分別鑒定到395、405和377個(gè)蛋白質(zhì)，總共鑒定463個(gè)蛋白質(zhì)，相同鑒定324個(gè)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)鑒定的重復(fù)率 (重復(fù)率=共同鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)/平均鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)×100%)為82.6% (圖2B)。3份同樣尿液硝酸纖維膜法處理共同鑒定蛋白質(zhì) (326蛋白質(zhì)) 與丙酮沉淀法處理共同鑒定蛋白質(zhì) (324蛋白質(zhì)) 相比，相同蛋白質(zhì)有237個(gè)，兩種方法鑒定蛋白質(zhì)的重復(fù)率 (重復(fù)率=共同鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)/平均鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)×100%)為73%。其中有89個(gè)蛋白質(zhì)僅在NC膜法中重復(fù)鑒定，有87個(gè)蛋白質(zhì)僅在丙酮沉淀法中重復(fù)鑒定。將兩種方法獨(dú)有鑒定蛋白質(zhì)分別按照蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分布范圍分類，見圖3和圖4。圖3顯示在蛋白質(zhì)分子量小于30 kDa范圍內(nèi)，丙酮沉淀法獨(dú)有鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目比例比NC膜法高，在大于30 kDa的范圍內(nèi)，NC膜法獨(dú)有鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目比例比丙酮沉淀法高。提示在保存分子量小于30 kDa的蛋白質(zhì)時(shí)丙酮沉淀法比NC膜法更優(yōu)異，在保存分子量大于30 kDa的蛋白質(zhì)時(shí)NC膜法比丙酮沉淀法更優(yōu)異。但是更重要的是在不同分子量范圍內(nèi)，兩種方法都有對方未鑒定蛋白質(zhì)，提示在保存不同分子量的蛋白質(zhì)樣本時(shí)，這兩種方法都具有互補(bǔ)性。圖4顯示在蛋白質(zhì)不同等電點(diǎn)分布范圍內(nèi)，兩種方法獨(dú)有鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目比例一致，提示兩種方法在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)選擇偏好性上沒有顯著差異。在不同等電點(diǎn)分布范圍內(nèi)，兩種方法同樣均有對方未鑒定蛋白質(zhì)，說明在保存不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣本時(shí)，這兩種方法同樣都具有互補(bǔ)性。

圖2 NC膜法 (NC) 和丙酮沉淀法 (AP) 蛋白質(zhì)鑒定重復(fù)率

2.3 兩種方法質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)譜圖數(shù)的變異系數(shù)比較

三個(gè)共同樣本經(jīng)硝酸纖維膜法處理共同鑒定326個(gè)蛋白質(zhì)，經(jīng)丙酮沉淀法處理共同鑒定324個(gè)蛋白質(zhì)，兩者蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目類似。將這些蛋白質(zhì)按照蛋白質(zhì)鑒定譜圖數(shù)的范圍進(jìn)行分類(圖5)。在200–1 000、100–200和50–100高譜圖數(shù)區(qū)間內(nèi)，硝酸纖維膜法鑒定蛋白質(zhì)稍微多一些，但并不顯著，總體看兩種方法鑒定蛋白質(zhì)數(shù)在譜圖數(shù)分布上并沒有明顯區(qū)別。

蛋白質(zhì)變異系數(shù)是評價(jià)兩種方法重復(fù)性的關(guān)鍵指標(biāo)。蛋白質(zhì)鑒定的譜圖數(shù)與蛋白量之間具有正相關(guān)性。將兩種方法鑒定蛋白質(zhì)按照蛋白質(zhì)鑒定譜圖數(shù)的CV值 (變異系數(shù)) 分類 (圖6)。兩種方法鑒定蛋白質(zhì)的CV值均主要集中在0–30%區(qū)間之內(nèi)，圖6B顯示0–30%區(qū)間內(nèi)兩種方法鑒定蛋白質(zhì)數(shù)幾乎相同，均占到了總鑒定蛋白質(zhì)數(shù)的3/4以上。雖然0–30%區(qū)間內(nèi)兩種方法鑒定蛋白質(zhì)數(shù)相同，但是圖6A顯示硝酸纖維膜法在10%–20%和20%–30%區(qū)間內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)少于丙酮沉淀法，而在變異系數(shù)最小的0–10%區(qū)間內(nèi)多于丙酮沉淀法，而這個(gè)區(qū)間蛋白質(zhì)數(shù)的區(qū)別甚至是圖6A六個(gè)區(qū)間區(qū)別中最大的，這說明在低變異系數(shù)區(qū)間內(nèi)，硝酸纖維膜法的表現(xiàn)甚至優(yōu)于丙酮沉淀法。但是總體看兩種方法鑒定蛋白質(zhì)在CV值上并沒有顯著區(qū)別，硝酸纖維膜法處理尿蛋白質(zhì)鑒定重復(fù)性與丙酮沉淀法類似。

圖4 NC膜法和丙酮沉淀法獨(dú)有鑒定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分布

圖5 NC膜法和丙酮沉淀法鑒定蛋白質(zhì)譜圖數(shù)分布

圖6 NC膜法和丙酮沉淀法鑒定蛋白質(zhì)變異系數(shù)分布

3 討論

生物標(biāo)志物研究終將進(jìn)入大規(guī)模臨床樣本驗(yàn)證階段。所需保存樣本的數(shù)量可能成千上萬，甚至幾十萬、上百萬都有可能。而且這種保存一定是跨區(qū)域 (中國各地) 和跨時(shí)間 (保存一個(gè)人從出生到死亡不同時(shí)間段) 的保存。尿液樣本中的蛋白質(zhì)富含人體重要信息，是一個(gè)亟待開發(fā)的生物標(biāo)志物“金礦”。因此一個(gè)簡單、經(jīng)濟(jì)、快速和持久保存尿蛋白質(zhì)樣本的方法無疑極大地促進(jìn)了生物標(biāo)志物的研究。將尿液快速通過硝酸纖維膜，蛋白質(zhì)迅速吸附在硝酸纖維膜上，將膜干燥真空保存，這種方法有望實(shí)現(xiàn)長久保存幾十萬尿蛋白質(zhì)樣本的需求。

丙酮沉淀是常用的尿液蛋白質(zhì)提取技術(shù)。加入丙酮的體積一般是尿液體積的3倍，而由于尿液具有體積大、濃度低的特點(diǎn)，丙酮沉淀處理方法需要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，不利于丙酮沉淀方法的應(yīng)用。本研究主要在方法重復(fù)性上將硝酸纖維膜法和丙酮沉淀法進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)兩者均具有較高的蛋白質(zhì)鑒定重復(fù)率 (硝酸纖維膜法80.2% vs 丙酮沉淀法82.6%)，兩者并沒有顯著區(qū)別。兩者鑒定蛋白質(zhì)數(shù)也沒有顯著區(qū)別 (硝酸纖維膜法326個(gè)蛋白質(zhì)vs丙酮沉淀法324個(gè)蛋白質(zhì))。將兩種鑒定蛋白質(zhì)的方法按照蛋白質(zhì)譜圖數(shù)的分布?xì)w類，兩者也沒有差異，甚至硝酸纖維膜法鑒定高譜圖數(shù)蛋白質(zhì)的數(shù)量還要稍多一些。按照譜圖數(shù)定量，將兩種鑒定蛋白質(zhì)的方法按照蛋白質(zhì)的CV值分布分類，發(fā)現(xiàn)不同CV值范圍內(nèi)兩種方法鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)目類似，甚至硝酸纖維膜法鑒定到更多數(shù)量的低CV值蛋白質(zhì)。綜上所述，硝酸纖維膜法處理尿蛋白質(zhì)的重復(fù)性與丙酮沉淀法一樣好。方法的重復(fù)性是決定其是否可用的最關(guān)鍵因素，因此硝酸纖維膜法可以應(yīng)用于大規(guī)模臨床尿液樣本的保存。只是受限于膜單位面積的載樣量，如果要保存大量的尿蛋白質(zhì)，則需要更大的膜面積。對于大量蛋白尿的情況，需要前期保存大量的蛋白質(zhì)以便后期去除高豐度蛋白質(zhì)后還有足夠的蛋白質(zhì)量，這種情況也許需要采用丙酮沉淀方法處理尿蛋白質(zhì)。如果不是這種情況，一般硝酸纖維膜保存的尿蛋白質(zhì)量足夠進(jìn)行質(zhì)譜分析和臨床驗(yàn)證。

但是硝酸纖維膜方法與丙酮沉淀法保存的蛋白質(zhì)不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)在保存分子量小于30 kDa的蛋白質(zhì)時(shí)丙酮沉淀法比NC膜法更優(yōu)異，在保存分子量大于30 kDa的蛋白質(zhì)時(shí)NC膜法比丙酮沉淀法更優(yōu)異。但是需要說明的是在不同分子量范圍內(nèi)，兩種方法都有對方未鑒定蛋白質(zhì)，在保存不同分子量的蛋白質(zhì)樣本時(shí)，這兩種方法都具有互補(bǔ)性。兩種方法在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)選擇偏好性上沒有顯著差異，在保存不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣本時(shí)，這兩種方法同樣都具有互補(bǔ)性。對于珍貴的蛋白質(zhì)樣本，建議采用兩種方法共同保存。因此在生物樣本庫建立的初始階段需要考慮不同方法保存尿蛋白質(zhì)的異同和各自優(yōu)缺點(diǎn)，選擇合適的保存技術(shù)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Comparison of two urinary protein preparation methods: nitrocellulose membrane preservation and acetone precipitation

Xiaorong Wang, Xundou Li, Lulu Jia, and Youhe Gao

National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Department of Physiology and Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China

Nitrocellulose membrane based urinary protein preservation method is simple, fast and economic, but its advantage over the traditionally used acetone precipitation method is still unclear. In this work, we prepared urinary proteins by the two methods by LC-MS/MS. Then we used protein spectra counts to assess the reproducibility of the two methods. Proteins identified by the two methods were almost the same in number, spectral count distribution and distribution of coefficients of variation value. In conclusion, nitrocellulose membrane method is generally the same as acetone precipitation method. It can be used for large scale preservation of clinical urine samples.

urinary proteins preservation, nitrocellulose membrane, proteomics, biological samples preservation

December 20, 2013; Accepted: May 5, 2014

National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2012CB517606, 2013CB530805), Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University-PCSIRT (No. IRT0909), 111 Project (No. B08007).

Youhe Gao. Tel: +86-10-69156493; E-mail: gaoyouhe@pumc.edu.cn Lulu Jia. E-mail: jluyu@126.com

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (Nos. 2012CB517606, 2013CB530805)，高校長江學(xué)者創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)(No. IRT0909)；111計(jì)劃(No. B08007) 資助。