SARS亞基疫苗-突刺蛋白受體結(jié)合區(qū)RBD在煙草葉綠體中的高效表達

鐘雪1,2*，齊廣勛1*，楊靜1，邢國杰1，劉劍鋒2，楊向東1

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SARS亞基疫苗-突刺蛋白受體結(jié)合區(qū)RBD在煙草葉綠體中的高效表達

鐘雪，齊廣勛，楊靜，邢國杰，劉劍鋒，楊向東

1吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林長春 130033 2吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林四平 136000

鐘雪, 齊廣勛, 楊靜, 等. SARS亞基疫苗-突刺蛋白受體結(jié)合區(qū)RBD在煙草葉綠體中的高效表達. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(6): 920?930.Zhong X, Qi GX, Yang J, et al.High-efficiency expression of a receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in tobacco chloroplasts. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 920?930.

葉綠體表達系統(tǒng)為植物源重組藥用蛋白和亞基疫苗的生產(chǎn)提供了一個有效的途徑。為驗證SARS亞基疫苗在葉綠體中表達的可行性，以及為植物源SARS亞基疫苗的生產(chǎn)提供一套高效、低成本的技術(shù)平臺，本研究將人工優(yōu)化合成的SARS-CoV突刺蛋白(S蛋白) 受體結(jié)合區(qū)序列RBD與載體分子CTB融合基因?qū)霟煵萑~綠體基因組中。PCR和Southern雜交分析表明，外源融合基因已整合到煙草葉綠體基因組中，并獲得同質(zhì)化。Western雜交分析表明，重組融合蛋白CTB-RBD在葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草中獲得表達，且主要以可溶性單體形式存在。ELISA分析表明，在不同生長階段、不同生長部位和不同時間點煙草葉片中，重組融合蛋白CTB-RBD的表達水平呈現(xiàn)明顯的變化。重組蛋白在成熟葉片中的表達水平最高可以達到10.2% TSP。本研究通過SARS亞基疫苗RBD在煙草葉綠體中的高效表達，有望為植物源SARS亞基疫苗的生產(chǎn)以及SARS血清抗體的檢測提供一個有效的技術(shù)平臺。

突刺受體結(jié)合區(qū)RBD，SARS，植物源亞基疫苗，葉綠體表達系統(tǒng)

疫苗接種免疫是目前控制疾病傳播最有效的方式。與傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)方式相比，葉綠體生產(chǎn)系統(tǒng)具有表達水平高、生產(chǎn)成本低、易實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)等多方面優(yōu)勢。葉綠體表達系統(tǒng)的一個顯著特點是外源重組蛋白可以在細胞中積累到很高水平。Oey等獲得了高表達內(nèi)溶素(GroupB streptococci，GBS) 的轉(zhuǎn)基因煙草，其成熟葉片中外源蛋白的表達水平達細胞可溶性蛋白(Total soluble protein，TSP) 含量的70%。外源重組蛋白的高水平表達不僅大幅度降低了純化成本，而且有效提高了藥用蛋白純化效果和重組疫苗口服免疫效果。盡管植物葉綠體起源于原核生物，但在長期的進化過程中，其蛋白表達和翻譯機制具有一些真核生物的特點。外源重組蛋白可以在葉綠體內(nèi)進行翻譯后修飾，如二硫鍵、酯基修飾等，從而進一步減少了后期體外修飾和加工等過程的成本。葉綠體多基因表達的特點也為同時表達多個藥用蛋白或是抗原和佐劑提供了良好的條件。葉綠體表達系統(tǒng)通過同源重組實現(xiàn)外源基因在葉綠體基因組中的定位整合，有效避免了諸如位置效應(yīng)、基因沉默等方面問題，為實現(xiàn)重組藥用蛋白生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制創(chuàng)造了有利條件。此外葉綠體表達系統(tǒng)克服了微生物和動物細胞生產(chǎn)系統(tǒng)中內(nèi)毒素、熱原、病毒污染等方面的問題。自Daniell等首次利用葉綠體表達霍亂毒素疫苗(Cholera toxin B，CTB) 以來，目前利用植物葉綠體表達的重組疫苗已達27種，包括抗病毒、抗細菌、抗病原蟲疫苗等。利用巨噬細胞裂解分析(Macrophage lysis assay)、神經(jīng)節(jié)苷脂 (Ganglioside) 結(jié)合試驗、病原攻毒試驗等體內(nèi)或體外試驗進一步證實了葉綠體表達重組疫苗的功能活性。由于外源重組疫苗抗原在葉綠體中的高水平表達以及有效誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)的特點，葉綠體表達系統(tǒng)為開辟新的疫苗免疫方式，實現(xiàn)疫苗口服提供了一條新的技術(shù)途徑?；谌~綠體表達系統(tǒng)多方面的優(yōu)勢，利用葉綠體作為反應(yīng)器生產(chǎn)各類具有重要應(yīng)用價值的重組藥用蛋白和亞基疫苗受到各國研究人員的廣泛重視。

嚴重急性冠狀呼吸綜合癥(Severe acute respiratory syndrome，SARS) 是由突變的冠狀病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV) 引起的一類新型急性呼吸系統(tǒng)傳染性疾病。該傳染病曾于2003年在世界范圍內(nèi)引起嚴重恐慌。盡管目前該傳染病在世界范圍內(nèi)得到控制，但一些研究表明，SARS病原體很有可能依然存在于某些野生動物中。在適當?shù)臈l件下，這些病原體很有可能再次傳染人類。至今為止，人類尚未研制出有效治療SARS 的藥物，除了采取消毒、隔離或阻斷病毒傳染等措施外，開發(fā)具有安全、高效、特異性SARS疫苗無疑是最為經(jīng)濟和有效的手段。SARS CoV 主要通過S突刺蛋白 (包含S1和S2亞基) 識別宿主細胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)進入人體細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)，S1亞基中N端的193氨基酸區(qū)域 (318–510 aa) 可以有效地結(jié)合機體細胞功能受體ACE2。攜帶受體結(jié)合區(qū) (Receptor binding domain，RBD) 序列的重組融合蛋白RBD-Fc可以有效地結(jié)合ACE2，并有效激發(fā)小鼠機體產(chǎn)生高水平的中和抗體反應(yīng)，抑制SARS CoV病毒的再次感染。因此，這一區(qū)域被認為是S蛋白的受體結(jié)合區(qū)，也是目前SARS亞基疫苗研究中的重要靶序列之一。本研究采用煙草作為表達宿主，利用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將RBD編碼基因?qū)霟煵萑~綠體基因組，獲得高效表達SARS亞基疫苗的葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植株，進而為SARS亞基疫苗的低成本、安全、高效生產(chǎn)及SARS血清抗體檢測提供一個有效的技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 S-RBD基因序列優(yōu)化及植物表達載體的構(gòu)建

根據(jù)煙草葉綠體高表達基因A序列(GenBank Accession No. HQ602934.1)，分析該基因的密碼子偏愛性 (http://www.kazusa.or.jp/ codon/)，并利用在線序列優(yōu)化工具 (http://www. Evolvingcode.Net) 對SARS CoV S蛋白受體結(jié)合區(qū)RBD (318–510 aa) 核苷酸序列進行人工優(yōu)化。優(yōu)化序列mRBD委托南京金斯瑞公司進行合成，并保存在克隆載體pES中。利用Ⅰ/Ⅰ雙酶切pES-mRBD和煙草葉綠體表達載體pLD-CTB-ESAT6，膠回收mRBD基因片段和pLD-CTB載體骨架片段。T4 DNA酶鏈接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單菌落進行PCR和酶切檢測。陽性轉(zhuǎn)化子送北京六合華大基因有限公司進行測序驗證。新構(gòu)建的載體命名為pLD-CTB-mRBD。試驗中用到的內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶等生化試劑均購自MBI公司。質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自天根生化科技有限公司(Tiangen)。

1.2 煙草葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化

試驗選用的轉(zhuǎn)化受體材料為煙草品種NC89 (本實驗室保存)。具體轉(zhuǎn)化方法參見Verma等的方法。將無菌培養(yǎng)的煙草植株葉片背軸面向上置于ROMP (MS鹽4.3 g；肌醇100 mg/L；VB1 mg/L；NAA 0.1 mg/L；6-BA 1.0 mg/L；蔗糖30%；植物凝膠0.5%；pH 5.8) 培養(yǎng)基中。采用基因槍轟擊法將包裹在金粉上的pLD-CTB- mRBD質(zhì)粒導(dǎo)入煙草葉綠體基因組。轟擊靶距為9 cm，壓力為7.586 MPa，金粉用量5 μg/槍，DNA與金粉質(zhì)量比為1∶500。轟擊后的煙草葉片在不含抗生素的ROMP培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d (25 ℃–28 ℃)后，用無菌手術(shù)刀片將葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，置于篩選培養(yǎng)基 (ROMP，500 mg/L壯觀霉素) 中進行篩選培養(yǎng) (25 ℃–28 ℃，16 h/8 h光/暗)，每2周繼代一次。將外植體上再生的綠色抗性芽切割為小塊，繼續(xù)進行同質(zhì)化篩選 (ROMP，500–700 mg/L壯觀霉素)。篩選3–4輪后，將抗性芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基 (1/2 MS，500 mg/L壯觀霉素) 中。待不定根長至3–4 cm時，將轉(zhuǎn)化苗移栽至溫室中生長。

1.3 PCR檢測

根據(jù)插入片段中序列及旁側(cè)煙草葉綠體基因組序列() 設(shè)計PCR檢測引物(表1)。探針模板擴增引物則根據(jù)煙草葉綠體基因組插入位點/序列(約800 bp) 進行設(shè)計。引物由北京六合華大基因有限公司合成。植物基因組提取采用天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒進行，具體提取方法參照試劑盒說明書。引物T3P/T3M PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物T5P/T2M PCR擴增程序：94℃ 5 min；94 ℃ 45 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 3.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 15 min。PCR擴增片段用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 Southern blotting雜交檢測

植物基因組大量提取采用CTAB法。植物總DNA用d Ⅲ單酶切后，在0.8%瓊脂糖凝膠中過夜電泳，并在高鹽 (20×SSC) 條件下轉(zhuǎn)移至帶正電荷的Hybood TM-N尼龍膜上。探針制備及雜交程序根據(jù)Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒說明書進行。雜交溫度42 ℃。洗膜條件為2×SSC (含0.1% SDS)，37 ℃條件下洗膜2次，每次5 min；0.5×SSC (含0.1% SDS)，66 ℃條件下洗膜2次，每次15 min。然后通過NBT化學(xué)顯色。

1.5 Western blotting雜交檢測

取新鮮煙草葉片約0.2 g，在液氮中充分研磨后，加入1 mL蛋白提取緩沖液 (100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, 200 mmol/L Tris-Cl, 0.05% Tween-20, 0.1% SDS, 14 mmol/L β-巰基乙醇，400 mmol/L蔗糖，2 mmol/L PMSF) 抽提5 min。12 000 r/min離心5 min后，取上清80 μL，加入5×上樣緩沖液20 μL，沸水中煮沸5 min。取20 μL上清液及沉淀 (等體積1×PBS緩沖液重新懸浮) 于12%聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)中電泳。利用電轉(zhuǎn)法 (Bio-Rad) 將蛋白轉(zhuǎn)移至BioTrace PVDF 膜 (PALL公司) 上。封閉液 (1×PBS, 0.1% Tween-20, 3%脫脂奶粉) 封閉1 h 后，加入CTB抗體 (1∶2 000，Abcam公司)，4 ℃孵育過夜。PBST 溶液 (1×PBS, 0.1% Tween-20) 洗膜3次。然后加入HRP標記羊抗兔IgG (1∶5 000，Abcam公司) 室溫孵育1 h。PBST溶液漂洗3次后，加入ECL發(fā)光檢測液 (GE Healthcare)，然后于暗室中曝光X光片，膠片顯影和定影后掃描。

表1 引物名稱及序列

1.6 ELISA分析

采用酶聯(lián)免疫吸附分析法 (ELISA) 對葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植株中外源融合蛋白的表達量進行分析。在轉(zhuǎn)基因植株不同生長階段 (幼苗期、成株期、衰老期)、煙草幼苗期階段不同生長部位 (上部、中部、下部) 和不同時間點 (上午8時，中午12時，下午6時)，分別提取葉片總蛋白，提取方法見上。用包被液 (15 mmol/L NaCO，35 mmol/L NaHCO，3 mmol/L NaN，pH 9.6) 將測試樣品和CTB標準蛋白進行系列稀釋 (50–1000 ng/mL) 后包被96孔酶標板。室溫條件下，封閉液封閉1 h。然后按1∶4 000比例加入CTB抗體 (一抗，1∶2 000) 孵育2 h。PBST 溶液洗3次。再用HRP標記的羊抗兔IgG (二抗，1∶5 000) 室溫孵育1.5 h，然后用PBST洗3次。加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB, Biochemi公司) 反應(yīng)10–15 min后，再加入2 mol HSO終止反應(yīng)。然后用酶標儀讀取吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SAR S蛋白受體結(jié)合區(qū)RBD序列優(yōu)化及葉綠體表達載體構(gòu)建

SARS CoV S糖蛋白在病毒與宿主細胞表面受體結(jié)合及介導(dǎo)病毒進入細胞的過程中起關(guān)鍵性作用。其中，S1亞基N末端318–510氨基酸可以有效結(jié)合宿主細胞表面的受體蛋白ACE2，是S糖蛋白的受體結(jié)合區(qū)部位，在引導(dǎo)病毒進入細胞內(nèi)部過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究根據(jù)煙草高表達基因序列的密碼子偏愛性，對RBD序列進行人工優(yōu)化。優(yōu)化后的RBD序列長度為579 bp，與原序列同源性為79.06%。GC含量為46% (圖1)。利用Ⅰ/Ⅰ內(nèi)切酶雙酶切pES-mRBD和煙草葉綠體表達載體pLD-CTB-ESAT6，將目的基因構(gòu)建到pLD- CTB-ESAT6上，并替換載體序列中原有的基因ESAT6。新載體命名為pLD-CTB-mRBD (圖2A)。測序結(jié)果表明，融合基因CTB-mRBD編碼框完整且序列正確。在構(gòu)建的葉綠體表達載體中，目的基因位于跨粘膜載體分子-霍亂毒素B亞基 (CTB) 基因序列 (321 bp) 的下游。融合基因CTB-mRBD之間含有一段間隔序列GGGCCCGGGCCC，該序列編碼空間位阻序列GPGP (Gly Pro Gly Pro)，可以避免載體分子CTB和靶蛋白mRBD之間的相互干擾。融合蛋白CTB-mRBD預(yù)測分子量為34 kDa。融合基因啟動子為葉綠體強啟動子(攜帶5′-非翻譯區(qū)序列)，終止子，篩選標記基因為，該基因編碼氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，具有抗壯觀霉素活性。pLD-CTB-mRBD載體中含有與煙草葉綠體基因組同源的序列和，該同源序列可以促進載體分子在煙草基因組中的定位整合，插入位點位于葉綠體基因組和基因序列間隔區(qū)。

圖1 優(yōu)化后mRBD序列與原序列S-RBD對比分析

圖2 煙草葉綠體表達載體pLD-CTB-mRBD示意圖

2.2 葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得及分子鑒定

本研究共獲得抗壯觀霉素轉(zhuǎn)化再生煙草植株35株，轉(zhuǎn)化頻率為0.7個抗性芽/槍。對轉(zhuǎn)化再生植株進行PCR檢測 (T3P/T3M，T5P/T2M)，結(jié)果顯示，其中19株能夠擴增出目的條帶，而對照非轉(zhuǎn)基因植株則沒有相應(yīng)的條帶，初步表明目的基因已整合到煙草葉綠體基因組中 (圖3)。其他陰性非轉(zhuǎn)基因植株的出現(xiàn)可能是由于核轉(zhuǎn)化或是煙草16S rRNA基因突變的原因。對獲得的19株P(guān)CR陽性植株進行3–4輪高壓篩選(500–700 mg/L壯觀霉素)，加快葉綠體基因組的同質(zhì)化。Southern雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因植株在9.5 kb左右處產(chǎn)生陽性雜交信號，而在7.67 kb處沒有條帶，表明目的基因已整合到葉綠體基因組中，并獲得同質(zhì)化 (圖4)。獲得的同質(zhì)化煙草轉(zhuǎn)基因植株移栽至溫室后能夠正常生長和結(jié)實，且在外部表型上與對照非轉(zhuǎn)基因植株無明顯差異 (圖5A，5B)。溫室中收獲的T1代轉(zhuǎn)基因煙草種子在含500 mg/L壯觀霉素培養(yǎng)基上能夠正常萌發(fā)生長，而對照非轉(zhuǎn)基因煙草幼苗則全部白化 (圖5C)，進一步表明轉(zhuǎn)基因煙草植株已獲得同質(zhì)化。

圖3 葉綠體轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR檢測

圖4 葉綠體轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交檢測

圖5 CTB-RBD葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植株生長與萌發(fā)

2.3 外源融合蛋白CTB-mRBD表達分析

為進一步分析外源融合蛋白CTB-mRBD在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達情況，我們利用CTB抗體進行Western雜交分析。結(jié)果表明，在非變性條件下提取的煙草葉片總蛋白中，融合蛋白在約34 kDa處有明顯的條帶，與預(yù)測分子量大小一致；融合蛋白在60–120 kDa處也出現(xiàn)了雜交信號，而在約11 kDa處則沒有出現(xiàn)信號，表明融合蛋白CTB-mRBD在細胞中主要以單體形式存在，部分以多聚體形式存在，且在細胞中沒有出現(xiàn)融合蛋白剪切現(xiàn)象 (圖6A)。對融合蛋白可溶性分析表明，融合蛋白主要以可溶性形式存在，在提取液沉淀中也發(fā)現(xiàn)有少量融合蛋白存在 (圖6B)。這一結(jié)果與Lakshmi等的研究相一致。

2.4 外源重組蛋白CTB-mRBD表達量分析

Western雜交分析表明，外源融合蛋白CTB-mRBD在細胞中主要以可溶性形式存在，因此，本研究采用ELISA方法對葉綠體轉(zhuǎn)基因煙草植株中CTB-mRBD的表達量進行分析。結(jié)果表明，在不同生長發(fā)育階段的煙草葉片中，成株期葉片細胞中的融合蛋白表達水平最高，達6.15% TSP。其次為幼苗期和衰老期葉片，其表達量分別為3.77% TSP和3.54% TSP (圖7A)。衰老葉片中外源融合蛋白表達水平的降低可能與葉片中蛋白酶活性增強的原因有關(guān)。對不同部位葉片中融合蛋白表達水平分析表明，中部葉片細胞中的蛋白表達水平最高 (3.58% TSP)，其次為上部葉片 (2.66% TSP) 和下部葉片 (1.54% TSP) (圖7B)。其表達水平變化趨勢與不同生長發(fā)育階段的煙草中融合蛋白表達量變化相一致。為進一步分析外源融合蛋白表達量受光照強度變化的影響程度，我們對不同時間點成熟煙草葉片外源融合蛋白的表達量進行了分析。結(jié)果表明，隨著光照強度的增加 (中午12時)，融合蛋白的表達水平最高，達到10.42% TSP，而在光照強度較低的時間段內(nèi) (上午8時，下午6時)，融合蛋白的表達水平則下降到8.76% TSP和8.00% TSP (圖7C)。融合蛋白表達水平隨光照強度的變化可能與煙草A啟動子有關(guān)，其表達效率受光照強度影響。

圖6 葉綠體轉(zhuǎn)基因植株Western雜交檢測

3 討論

已有的研究表明，注射或口服植物源病毒亞基疫苗可以有效誘導(dǎo)試驗動物產(chǎn)生粘膜和血清免疫反應(yīng)。在植物中表達的疫苗抗原同時也可以用來血清抗體檢測。SARS CoV主要通過其表面S糖蛋白識別宿主細胞上的受體進入細胞。研究表明，S蛋白含有重要的抗原表位，在介導(dǎo)病毒與宿主細胞表面受體結(jié)合及介導(dǎo)病毒進入細胞過程中起著關(guān)鍵性作用。S糖蛋白的S1亞基中318–510氨基酸區(qū)域可以有效地結(jié)合機體細胞功能受體ACE2，因此，這一區(qū)域也被認為是SARS病毒S蛋白的受體結(jié)合區(qū)RBD。Babcock等利用哺乳動物細胞表達S糖蛋白1–1 190氨基酸區(qū)域。結(jié)果表明，S1190糖蛋白在動物細胞中能夠進行正確的翻譯后修飾，且能夠有效結(jié)合Vero細胞表明受體。Wang等利用HEK293細胞表達了RBD-Fc融合蛋白 (人免疫球蛋白G1的Fc段)。流式細胞儀分析表明，純化RBD-Fc能夠有效結(jié)合細胞表明受體ACE2，并引導(dǎo)融合蛋白進入細胞。原核表達研究表明，攜帶RBD序列的重組融合蛋白RBD-Fc可以有效地結(jié)合ACE2，其結(jié)合效率顯著高于S1糖蛋白。進一步實驗研究發(fā)現(xiàn)，進入細胞的RBD可以有效激發(fā)小鼠機體產(chǎn)生高水平的中和抗體反應(yīng)。攻毒實驗表明，誘發(fā)產(chǎn)生的中和抗體可以有效識別S蛋白的RBD序列，并抑制SARS CoV病毒的再次感染。在利用植物表達重組SARS亞基疫苗方面，Li等首次在煙草中表達了SARS CoV S突刺蛋白S1亞基1–658氨基酸區(qū)域，外源重組蛋白表達水平達細胞可溶性蛋白0.2%。不過，目前尚未見到有利用葉綠體特異性表達S突刺蛋白受體結(jié)合區(qū)RBD的報道。

Daniell等的研究表明，葉綠體表達CTB重組蛋白通常以聚合體的形式存在。CTB聚合體能夠有效結(jié)合腸道上皮細胞膜上的受體，并誘發(fā)抗原特異性抗體反應(yīng)。本研究利用煙草葉綠體表達的重組融合蛋白CTB-RBD在細胞中主要以可溶性單體的形式存在，部分以多聚體形式存在。在本實驗條件下沒有檢測到重組融合蛋白CTB-RBD被剪切為單體的現(xiàn)象，這一點與Lakshmi等的研究結(jié)果不同。外源重組蛋白在葉綠體中的表達水平受多方面因素的影響。除了與轉(zhuǎn)錄和翻譯效率等因素有關(guān)外，外源融合蛋白的穩(wěn)定性及葉綠體發(fā)育程度也是影響其表達水平的重要因素。在本研究中，衰老葉片和下部葉片中的重組蛋白表達水平都明顯降低，其原因可能與衰老葉片中蛋白酶活性增強或是細胞中葉綠體降解等因素有關(guān)。而成熟葉片中外源蛋白的表達水平顯著高于幼苗期葉片則可能與成熟葉片中葉綠體數(shù)量較多 (成熟煙草細胞中的葉綠體數(shù)量達100多個，基因組拷貝數(shù)達10 000個以上) 且發(fā)育程度較高等原因有關(guān)。這一結(jié)果與其他葉綠體表達重組藥用蛋白研究一致。另外，本研究選用的煙草A啟動子顯著影響外源重組蛋白表達水平，該啟動子的表達效率受到光照強度的明顯影響。在光照強度較高時 (中午12時)，外源融合蛋白CTB-RBD的表達水平可以達到10.42% TSP，而隨著光照強度的降低，外源融合蛋白的表達量也隨之降低。關(guān)于葉綠體表達融合蛋白RBD功能活性問題，已有的研究表明，CTB及空間位阻序列GPGP不會影響重組疫苗抗原的功能。在后期的研究中，我們將利用RBD特異抗體及受體ACE2結(jié)合試驗，進一步明確重組RBD的活性功能，并期望最終為植物源SARS亞基疫苗RBD的生產(chǎn)以及SARS血清抗體檢測提供一套低成本、安全、高效的技術(shù)平臺。

致謝：本文通訊作者曾在美國中佛羅里達大學(xué)Henry Daniell教授實驗室進行為期一年的訪問學(xué)習(xí)，期間Henry Daniell教授在葉綠體生物反應(yīng)器研究方面給作者進行了細致的指導(dǎo)，在此一并致謝。

REFERENCES

[1] De CB, Moar W, Lee SB, et al. Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nat Biotechnol, 2001, 19(1): 71–74.

[2] Bally J, Nadai M, Vitel M, et al. Plant physiological adaptations to the massive foreign protein synthesis occurring in recombinant chloroplasts. Plant Physiol, 2009, 150(3): 1474–1481.

[3] Oey M, Lohse M, Kreikemeyer B, et al. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic. Plant J, 2009, 57(3): 436–445.

[4] Maliga P, Bock R. Plastid biotechnology: food, fuel, and medicine for the 21century. Plant Physiol, 2011, 155(4): 1501–1510.

[5] Arlen PA, Singleton M, Adamovicz JJ, et al. Effective plague vaccination via oral delivery of plant cells expressing F1-V antigens in chloroplasts. Infect Immun, 2008, 76(8): 3640–3650.

[6] Gisby MF, Mellors P, Madesis P, et al. A synthetic gene increases TGFb3 accumulation by 75-fold in tobacco chloroplasts enabling rapid purification and folding into a biologically active molecule. Plant Biotechnol J, 2011, 9(5): 618–628.

[7] Glenz K, Bouchon B, Stehle T, et al. Production of a recombinant bacterial lipoprotein in higher plant chloroplasts. Nat Biotechnol, 2006, 24(1): 76–77.

[8] Goldstein DA, Thomas JA. Biopharmaceuticals derived from genetically modified plants. Q J Med, 2004, 97(11): 705–716.

[9] Daniell H, Lee SB, Panchal T, et al. Expression of the native cholera toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts. J Mol Biol, 2001, 311(5): 1001–1009.

[10] Zhong X, Qi GX, Kang LS, et al. Recent advances in recombinant pharmaceutical proteins and vaccines production in chloroplasts. J Agril Biotech, 2012, 20(9): 1080–1096 (in Chinese). 鐘雪, 齊廣勛, 康嶺生, 等. 利用植物葉綠體表達重組藥用蛋白和疫苗研究進展. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2012, 20(9): 1080–1096.

[11] Kang TJ, Loc NH, Jang MO, et al. Expression of the B subunit of.heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization. Transgenic Res, 2003, 12(6): 683–691.

[12] Shao HB, He DM, Qian KX, et al. The expression of classical swine fever virus structural protein E2 gene in tobacco chloroplasts for applying chloroplasts as bioreactors. Comptes Rendus Biologies, 2008, 331(3): 179–184.

[13] McBride R, Fielding BC. The role of severe acute respiratory syndrome (SARS)-coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses, 2012, 4(11): 2902–2923.

[14] Wang SX, Guo F, Liu KT, et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptorACE2. Virus Res, 2008, 136(1/2): 8–15.

[15] Wong SK, Li WH, Moore ML, et al. A 193-amino acid fragment of the SARS coronavirus S protein efficiently binds angiotensin-converting enzyme 2. J Biol Chem, 2004, 279(5): 3197–3201.

[16] Chen J, Miao L, Li JM, et al. Receptor-binding domain of SARS-Cov spike protein: soluble expression in, purification and functional characterization. World J Gastroenterol, 2005, 11(39): 6159–6164.

[17] He YX, Lu H, Siddiqui P, et al. Receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein contains multiple conformation-dependent epitopes that induce highly potent neutralizing antibodies. J Immunol, 2005, 174(8): 4908–4915.

[18] Verma D, Samson NP, Koya V, et al. A protocol for expression of foreign genes in chloroplasts. Nat Protocols, 2008, 3(4): 739–758.

[19] Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. UNIT 2.3: Preparation of Genomic DNA from Plant Tissue in Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley, 1995.

[20] Lakshmi PS, Verma D, Yang XD, et al. Low cost tuberculosis vaccine antigens in capsules: expression in chloroplasts, bio-encapsulation, stability and functional evaluation. PLoS ONE, 2013, 8(1): e54708.

[21] Verma D, Daniell H. Chloroplast vector systems for biotechnology applications. Plant Physiol, 2007, 145(4): 1129–1143.

[22] Davoodi SA, Samson N, Daniell H. The green vaccine: a global strategy to combat infectious and autoimmolune diseases. Hum Vaccin, 2009, 5(7): 488–493.

[23] Bosch BJ, Cornelis AM, Peter JM, et al. The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein:structural and functional characterization of the fusion core complex. J Virol, 2003, 77(16): 8801–8811.

[24] Chakraborti S, Prabakaran P, Xiao XD, et al. The SARS coronavirus S glycoprotein receptor binding domain: fine mapping and functional characterization. Virol J, 2005, 2: 73–80.

[25] Babcock GJ, Esshaki DJ, Thomas WD, et al. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J Virol, 2004, 78(9): 4552–4560.

[26] Li HY, Ramalingam S, Chye ML. Accumulation of recombinant SARS-CoV spike protein in plant cytosol and chloroplasts indicate potential for development of plant-derived oral vaccines. Exp Biol Med, 2006, 231(8): 1346–1352.

[27] Koya V, Moayeri M, Leppla SH, et al. Plant-based vaccine: mice immolunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge. Infection Immun, 2005, 73(12): 8266–8274.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

High-efficiency expression of a receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in tobacco chloroplasts

Xue Zhong, Guangxun Qi, Jing Yang, Guojie Xing, Jianfeng Liu, and Xiangdong Yang

1 Agricultural Biotechnology Research Institute, Jilin Academy of Agriculture Sciences, Changchun 130033, Jilin, China 2 College of Life Sciences, Jilin Normal University, Siping 136000, Jilin, China

Chloroplast-based expression system is promising for the hyper-expression of plant-derived recombinant therapeutic proteins and vaccines. To verify the feasibility of obtaining high-level expression of the SARS subunit vaccine and to provide a suitable plant-derived vaccine production platform against the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), a 193-amino acid fragment of SARS CoV spike protein receptor-binding domain (RBD), fused with the peptide vector cholera toxin B subunit (CTB), was expressed in tobacco chloroplasts. Codon-optimized CTB-RBD sequence was integrated into the chloroplast genome and homoplasmy was obtained, as confirmed by PCR and Southern blot analysis. Western blot showed expression of the recombinant fusion protein mostly in soluble monomeric form. Quantification of the recombinant fusion protein CTB-RBD was conducted by ELISA analysis from the transplastomic leaves at different developmental stages, attachment positions and time points in a day and the different expression levels of the CTB-RBD were observed with the highest expression of 10.2% total soluble protein obtained from mature transplastomic leaves. Taken together, our results demonstrate the feasibility of highly expressing SARS subunit vaccine RBD, indicating its potential in subsequent development of a plant-derived recombinant subunit vaccine and reagents production for antibody detection in SARS serological tests.

receptor-binding domain of spike protein, SARS, plant-derived subunit vaccine, chloroplast expression system

September 18, 2013; Accepted:December 9, 2013

National Natural Science Foundation of China (No. 31000743), Innovation Program of Jilin Academy of Agriculture Sciences.

Xiangdong Yang. Tel: +86-431-87063044; E-mail: xdyang020918@126.com.

These authors contributed equally to this study.

國家自然科學(xué)基金(No. 31000743)，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目資助。