功效測(cè)試及誤差測(cè)試——通過皮膚模型來進(jìn)行基因測(cè)試

洪爾雨

根據(jù)最近一次歐盟的立法規(guī)定（第1223/2009號(hào)法規(guī)），進(jìn)口到歐盟并在歐盟出售的產(chǎn)品不再允許用動(dòng)物做測(cè)試。于是，在研制新型活性劑及配方時(shí)，活體外皮膚模型為減少動(dòng)物測(cè)試做出了意義重大的貢獻(xiàn)。

皮膚模型

一件表皮模型具有與按照人類皮膚細(xì)胞組成制作的活體外皮膚模型有相同的功效。在一件完整的皮膚模型中，這件模型相當(dāng)于覆蓋在表皮上的真皮。不過，在某些皮膚模型的基底細(xì)胞層里還存在著黑色素。

為了在不使用動(dòng)物的情況下能夠?qū)ξ镔|(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，比如說那些影響曬黑程度的物質(zhì)，這類皮膚模型正是恰當(dāng)?shù)倪x擇。活體外皮膚模型對(duì)活性劑的反應(yīng)與人類皮膚相同。因此，在做美容及護(hù)膚產(chǎn)品的功效測(cè)試時(shí)，該模型正是你理解的工具。

表皮模型是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）批準(zhǔn)的可用于刺激性及腐蝕性測(cè)試的動(dòng)物模型替代品：

OECD測(cè)試第439號(hào)：活體外皮膚刺激——重新構(gòu)建的人類表皮測(cè)試方法

OECD測(cè)試第431號(hào)：活體外皮膚腐蝕——重新構(gòu)建的人類表皮測(cè)試方法

皮膚斷面法

為了分析皮膚細(xì)胞、皮膚模型及細(xì)胞培養(yǎng)在使用美容產(chǎn)品時(shí)的變化，我們需要使用現(xiàn)代斷面技術(shù)。

現(xiàn)代斷面技術(shù)要使用工具，進(jìn)而可以分析出使用面霜及其他美容產(chǎn)品時(shí)復(fù)雜的分子變化?；蚪M、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組測(cè)試都是補(bǔ)充測(cè)試。

在過去，解決某些問題的辦法只能是取得足夠數(shù)量的皮膚，進(jìn)而取得足夠的RNA以供分析。使用皮膚模型測(cè)試活性劑的一大優(yōu)點(diǎn)是：一件皮膚模型中五微克優(yōu)質(zhì)RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）就可用于單個(gè)基因的芯片分析或基因表達(dá)分析。此外，人類皮膚模型可按需獲得。某些針對(duì)皮膚模型的芯片及陣列技術(shù)已經(jīng)得到公布，并將進(jìn)行更深入的研究。

研究人員針對(duì)某些單個(gè)分析過的基因或基因族皮膚模型做出了大量研究。其他研究小組也做過些觀察，比如使用過小核測(cè)試來觀察皮膚模型中一些物質(zhì)引發(fā)的基因行為。

目標(biāo)基因分析

國(guó)際人類基因組測(cè)序團(tuán)隊(duì)已經(jīng)將人類基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的數(shù)量更正為20.000～25.000個(gè)。過去十年來DNA陣列及寡核苷酸芯片（oligochip）技術(shù)的發(fā)展首次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分析數(shù)千組基因的表達(dá)水平?，F(xiàn)代斷面法的使用也實(shí)現(xiàn)了在單獨(dú)一次實(shí)驗(yàn)里分析所有已知的基因。

陣列及芯片技術(shù)

雖然實(shí)驗(yàn)室里廣泛地用到了芯片技術(shù)，RNA斷面的三維模型的應(yīng)用卻比較少。按理說，與皮膚模型共同使用的話，基因表達(dá)式斷面的應(yīng)用要容易一些。

陣列分析的基本原則依據(jù)核酸的互補(bǔ)堿基對(duì)的雜交情況而定。RNA樣本中標(biāo)記的待分析互補(bǔ)DNA分子，在一組液相中與處于固相中正在分析的基因片斷組合在一起（芯片或陣列中的點(diǎn)）。

芯片雜交的基本原則包括兩段RNA樣本的逆轉(zhuǎn)錄。借助逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成的互補(bǔ)DNA都被打上了熒光色分子的標(biāo)記。依據(jù)互補(bǔ)堿基配對(duì)的原則，在雜交過程中互補(bǔ)DNA分子都被組合到一些點(diǎn)上，而在這些點(diǎn)上重點(diǎn)基因的補(bǔ)足DNA的順序都做了標(biāo)記。一件樣本中指定的RNA數(shù)量越大，雜交的信號(hào)就越強(qiáng)烈。如果我們同時(shí)分析上千個(gè)基因的表達(dá)，我們可以使用一款特殊的軟件，它有復(fù)雜的算法，可分析巨量數(shù)據(jù)。在陣列實(shí)驗(yàn)的分析及呈現(xiàn)過程中，將芯片數(shù)據(jù)集中是很受關(guān)注且很受歡迎的一個(gè)步驟。這樣，基因便按照它們的規(guī)則排序并著色。例如，可以從一塊腫瘤中分離出一些細(xì)胞，然后按不同數(shù)量的細(xì)胞培養(yǎng)傳代來培養(yǎng)，以便接下來細(xì)胞分析工作的開展，弄清不同培養(yǎng)條件下基因表達(dá)斷面的不同變化，于是就可以看出在與生成這些細(xì)胞系的腫瘤相對(duì)比下這些細(xì)胞系基因表達(dá)的不同點(diǎn)。

在各自的實(shí)驗(yàn)中有些基因表現(xiàn)出類似的規(guī)則，把他們集中起來，也就是分組。有共同規(guī)則的細(xì)胞系出現(xiàn)得越少，他們的分類就越細(xì)。于是，我們可以看到，隨著細(xì)胞傳代數(shù)量的不斷增加，在更改后的基因表達(dá)樣本中細(xì)胞系都被分離出來了。

各類傳代數(shù)量（早期、中期、晚期）可以展示出分等級(jí)集中細(xì)胞系（1C6，1H11）中587組基因表達(dá)的不同。他們是作為一個(gè)集合中的基本腫瘤而制成的。

基因組學(xué)

遺傳病通常是由基因的擴(kuò)增與刪除造成的。描述出惡性組織中基因復(fù)制的特性，這將有助于得出對(duì)這類疾病更詳細(xì)的診斷及預(yù)后結(jié)果。

因此，在遺傳病預(yù)診的臨床醫(yī)學(xué)方面，染色體組型分析方法已成功創(chuàng)建，并已成為一種惡性腫瘤的診斷手段。在腫瘤病例中會(huì)特別用到基因突變分析。在皮膚模型中小核鑒定用于衡量基因中毒性物質(zhì)的嚴(yán)重程度。

蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)方法有助于分析個(gè)基因組中一件樣本的蛋白質(zhì)與其修改情況。因?yàn)榉治龌蚪M及轉(zhuǎn)錄組無法提供任何有關(guān)編碼蛋白質(zhì)活動(dòng)等級(jí)的信息，所以蛋白質(zhì)組分析有助于理解多種疾病的分子基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組遠(yuǎn)比轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜，因?yàn)樗€處于幼兒期，所以其技術(shù)平臺(tái)更加狹窄。

在皮膚模型中也可以見到皮膚中非常復(fù)雜的活動(dòng)，利用恰當(dāng)?shù)姆椒ㄒ材軌虮鎰e出這些活動(dòng)。與基于活體檢查的方法正相反，皮膚模型的優(yōu)勢(shì)在于可生成足夠分析的材料。此外，這種物質(zhì)可在無單獨(dú)變化的條件下復(fù)制。在一次實(shí)驗(yàn)中，基因表達(dá)能夠概括皮膚模型中表達(dá)出的幾乎所有基因的活動(dòng)。

*可上網(wǎng)查找該領(lǐng)域中已發(fā)表的研究與例圖（見因特網(wǎng)信息框）。endprint