3D重組皮膚模型研究進(jìn)展與OECD新規(guī)

在眾多的人類組織工程學(xué)體外模型皮膚中，皮膚組織的三維（3D）重組模型是其中最完善的模型之一。制藥業(yè)和化妝品行業(yè)對(duì)于動(dòng)物模型的替代方法巨大的需求，推動(dòng)了皮膚模型的發(fā)展進(jìn)步。2013年7月26日，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織

（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）再次更新試驗(yàn)指南TG43l和TG439，對(duì)于使用3D皮膚模型進(jìn)行體外皮膚腐蝕性、刺激性試驗(yàn)，提出更具體的要求。本篇綜述重點(diǎn)介紹由角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的重組表皮模型（Reconstructed Human Epidermis Made of Keratinocyte，RHE），概述其檢測(cè)原理，以及OECD對(duì)于應(yīng)用此類體外模型的最新標(biāo)準(zhǔn)。簡(jiǎn)單介紹其他種類的皮膚模型，并對(duì)我國(guó)目前動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的研究成果和前景進(jìn)行討論和總結(jié)。

關(guān)鍵詞：皮膚模型，動(dòng)物試驗(yàn)替代方法，OECD規(guī)則

引言

皮膚作為人類最大的器官，包含多種類型的細(xì)胞，這些細(xì)胞相互影響，協(xié)同作用，構(gòu)成阻擋有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的第一道天然屏障。角質(zhì)層作為皮膚屏障作用的主要執(zhí)行者，是由表皮層基底的角質(zhì)細(xì)胞不斷分化而來(lái)（如圖1）。在表皮層中，除了角質(zhì)細(xì)胞，還有黑色素細(xì)胞和朗罕氏細(xì)胞。表皮層通過(guò)一層基膜與其下面的真皮層相連接。真皮層分為乳突層和網(wǎng)狀層，前者含有的膠原纖維排列疏松，后者的膠原纖維排列致密并且與皮膚表面平行。這些膠原纖維由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，含有大量的彈性蛋白，為皮膚提供彈性。不同于表皮層沒(méi)有血管的結(jié)構(gòu)，真皮層內(nèi)富含血管、淋巴管、神經(jīng)、汗腺、皮脂腺和毛囊。

皮膚的疾病可能由多種原因造成，比如細(xì)胞代謝紊亂、傳染病，對(duì)外界抗原的免疫性反應(yīng)或是物理性、化學(xué)性的傷害。病因的多樣性和復(fù)雜性使得在藥物研發(fā)領(lǐng)域，對(duì)于體外皮膚模型的需要日益增長(zhǎng)。另外，出于法律和道德的要求，國(guó)外化妝品行業(yè)同樣重視體外皮膚模型的使用。2013年7月26日，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation andDevelopment.OECD）再次更新試驗(yàn)指南TG431和TG439（以下簡(jiǎn)稱2013版指南），對(duì)于體外皮膚腐蝕性、刺激性試驗(yàn)提出更詳盡的要求。

大量的研究促使人類皮膚模型不斷進(jìn)步，從依靠滋養(yǎng)層培養(yǎng)到表皮替代物以及多種類型細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。目前皮膚模型主要分為兩大類，一類是致力于開(kāi)發(fā)更為精細(xì)復(fù)雜的皮膚模型，用于皮膚疾病的治療，培養(yǎng)條件和結(jié)果判定也相應(yīng)的更復(fù)雜。已經(jīng)建立的比較好的模型是包含有角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的全皮模型（fullthickness.FT），還有更為復(fù)雜的加入了其他類型細(xì)胞（如黑色素細(xì)胞，干細(xì)胞，朗罕氏細(xì)胞）或者可以與其他器官相互作用的模型。第二類則是已經(jīng)進(jìn)入量產(chǎn)并且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的由角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的重組表皮模型，主要用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，具有很好的可重復(fù)性。本文將重點(diǎn)討論第二類皮膚模型，并簡(jiǎn)單介紹其他模型。

由角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的重組表皮模型

1.概況

為滿足研究者和工業(yè)界對(duì)于皮膚模型不同的需求，現(xiàn)有的皮膚模型有多種類型。最基本的是只含角質(zhì)細(xì)胞的皮膚模型，即由角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的重組表皮模型（Reconstructed HumanEpidermis Made of Keratinocyte.RHE）。RHE是在特定條件下培養(yǎng)人類角質(zhì)細(xì)胞，并通過(guò)氣液面培養(yǎng)的方式得到角質(zhì)層，基本具有類似于人表皮的組織結(jié)構(gòu)（如圖2）。

1998年，首批皮膚模型（EpiSkin和EpiDerm^TM）被替代方法歐洲研究中心（EuropeanCentre for the Validation of AlternativeMethods.ECVAM）批準(zhǔn)用于皮膚腐蝕性預(yù)測(cè)，并于2004年隨著OECD試驗(yàn)指南的出版而在國(guó)際上被廣泛接受。不久之后，其他滿足經(jīng)合組織試驗(yàn)指南要求的模型陸續(xù)被批準(zhǔn)。2008年經(jīng)過(guò)調(diào)整的EpiDerm SIT和SkinEthic被批準(zhǔn)用于皮膚刺激性預(yù)測(cè)。

2.檢測(cè)原理

RHE對(duì)于有潛在腐蝕性或刺激性物質(zhì)的預(yù)測(cè)是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞存活率的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。即待檢測(cè)物質(zhì)滲透至角質(zhì)層以下的細(xì)胞層，如果對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，就會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡。使用3-（4.5-二甲基噻唑-2）-2.5二苯基四氮唑溴鹽（簡(jiǎn)稱MTT）檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)組吸光值（OD值）和陰性對(duì)照組的比值，確定細(xì)胞活率的變化。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)對(duì)于活細(xì)胞有刺激作用時(shí)，細(xì)胞會(huì)分泌系列迅速引起皮膚炎癥的因子，如IL-1α，對(duì)其定量分析可以輔助評(píng)估細(xì)胞受到刺激的程度和體外炎癥起始的級(jí)聯(lián)反應(yīng)/作用機(jī)理。所以對(duì)于刺激性物質(zhì)通常會(huì)選用MTT和IL-1α雙終點(diǎn)判定。

3.OECD 2013版指南對(duì)于皮膚模型的基本要求

RHE主要目的是對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)和評(píng)估，所以必須保證試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。在2013版試驗(yàn)指南中，OECD提出了皮膚模型的“執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)”（performance standard），規(guī)定如果向OECD申請(qǐng)認(rèn)證新的或類似的皮膚模型，必須符合此“執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)”。其中關(guān)于皮膚模型的質(zhì)量制定了五項(xiàng)基本標(biāo)準(zhǔn)，概況如下：

1）細(xì)胞活性：每批次的RHE必須達(dá)到規(guī)定的陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，即細(xì)胞活率達(dá)到特定數(shù)值。不同生產(chǎn)商標(biāo)準(zhǔn)有所不同，如表1，OD值過(guò)低，說(shuō)明RHE自身活細(xì)胞數(shù)目少，活率低，可能無(wú)法真實(shí)反應(yīng)待測(cè)物質(zhì)的腐蝕性或刺激性；相反，如果OD值太高，說(shuō)明RHE細(xì)胞數(shù)量過(guò)多，可能對(duì)于毒性有耐受，同樣無(wú)法獲得真實(shí)結(jié)果。

2）屏障作用：角質(zhì)層及其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的屏障作用能夠在一定程度上抵擋特定有害物質(zhì)的快速滲透。一般使用SDS或者1%Triton-100作用于RHE表面，計(jì)算細(xì)胞活率下降50%所需要的時(shí)間（ET₅₀）或者劑量（C₅₀），兩個(gè)值需在定范圍內(nèi)（如表2），過(guò)低或者過(guò)高表明角質(zhì)層太薄或者太厚，都不能真實(shí)預(yù)測(cè)待檢物質(zhì)的毒性作用。endprint

3）組織結(jié)構(gòu)：必須具備人表皮樣結(jié)構(gòu)，即有基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層。

4）可重復(fù)性：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的試驗(yàn)結(jié)果必須具有可重復(fù)性。

5）質(zhì)量控制：需要將以上四點(diǎn)信息告知使用者，并保證每個(gè)批次的RHE各項(xiàng)指標(biāo)均在規(guī)定范圍內(nèi)。

另外，“執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)”中針對(duì)皮膚腐蝕性/刺激性試驗(yàn)。分別提供了參考化學(xué)品名錄（MinimumList of Reference Chemicals）。并且更改了腐蝕性試驗(yàn)化學(xué)品的分類方法，由之前分為兩類（腐蝕性和非腐蝕性）改為三類（1A、1B-and-1C、和NC），1A代表強(qiáng)腐蝕性，1B-and-lC代表中等腐蝕性，NC代表非腐蝕性（如表3）。刺激性試驗(yàn)化學(xué)品依舊分為兩大類——刺激性和非刺激性（如表4）。

4.OECD 2013版指南對(duì)于試驗(yàn)操作的基本要求

對(duì)于應(yīng)用RHE進(jìn)行皮膚刺激性或腐蝕性試驗(yàn)操作，2013版指南也提出具體要求，簡(jiǎn)單概括以下幾點(diǎn)：

1）每個(gè)待測(cè)品有2～3個(gè)皮膚組織作為重復(fù)。

2）根據(jù)待測(cè)品性質(zhì)和皮膚組織面積規(guī)定最少用量。

3）根據(jù)待測(cè)品種類選擇2個(gè)或3個(gè)暴露時(shí)問(wèn)，對(duì)于刺激性化學(xué)品，一般暴露60分鐘，清洗再培養(yǎng)42小時(shí)后檢測(cè)；對(duì)于腐蝕性化學(xué)品，一般選擇3分鐘和60分鐘兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

4）陰性對(duì)照可選擇生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。

其他類型的重組皮膚模型

1.全皮模型（Full ThicKness，F(xiàn)T）

全皮模型通常包含有角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及膠原基質(zhì)。通常是由膠原蛋白和人的皮膚成纖維細(xì)胞結(jié)合形成基質(zhì)，然后將角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于基質(zhì)之上，同樣經(jīng)過(guò)氣液面培養(yǎng)形成角質(zhì)層。與表皮模型十分明確的培養(yǎng)條件不同的是，全皮模型的培養(yǎng)過(guò)程中加入血清（為了成纖維細(xì)胞的存活）。血清作為種天然產(chǎn)物，每批次的各種蛋白含量，如生長(zhǎng)因子，都有可能不同，從而導(dǎo)致全皮模型批次問(wèn)的差異。但是全皮模型的角質(zhì)層屏障作用更強(qiáng)，得到的結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)致性更好。

2.含有色素細(xì)胞的皮膚模型

由Duval等建立的含有色素細(xì)胞的皮膚模型，是迄今為止最為完善的且在生理學(xué)上被證明的皮膚模型。盡管黑色素細(xì)胞是最早被研究者試圖加入到皮膚模型中的細(xì)胞，但是因?yàn)榻琴|(zhì)細(xì)胞參與調(diào)解黑色素細(xì)胞的附著、存活和形態(tài)，所以經(jīng)歷了將近30年，研究者才得到令人滿意的模型。含有色素細(xì)胞的皮膚模型，一方面將幫助制藥企業(yè)研發(fā)治療白癜風(fēng)等疾病的藥物；另方面，將對(duì)化妝品企業(yè)研發(fā)美白產(chǎn)品起到幫助作用。

3.含有朗罕氏細(xì)胞的皮膚模型

因?yàn)槠つw是抵擋外界侵害的屏障，所以它也是免疫反應(yīng)多發(fā)的部位。表皮中有促炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞包括：角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和上皮的樹(shù)突狀細(xì)胞（又名為朗罕氏細(xì)胞）。目前，對(duì)于含有朗罕氏細(xì)胞的皮膚模型，都集中于器官型培養(yǎng)，用于皮炎治療等方面的研究。

國(guó)內(nèi)重組皮膚模型前景

盡管人類皮膚模型在國(guó)外已經(jīng)有40多年的發(fā)展歷史，并已經(jīng)形成法律規(guī)范，歐盟化妝品規(guī)程第7次修正案（2003/15/EC.2003）中規(guī)定，自2009年3月起在歐盟范圍內(nèi)禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品毒性和過(guò)敏試驗(yàn)，2013年起禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品原料的安全性評(píng)價(jià)，逐步不允許成員國(guó)從外國(guó)進(jìn)口和銷售進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品。但是在我國(guó)，動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的研究仍處于起步階段，各類產(chǎn)品的皮膚安全性評(píng)價(jià)仍依賴傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)。

為建立與國(guó)際接軌、并符合我國(guó)目前研究水平和應(yīng)用需求的化妝品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)體系，提升我國(guó)突破化妝品國(guó)際貿(mào)易中技術(shù)壁壘的能力，2011年8月國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局啟動(dòng)了《化妝品動(dòng)物試驗(yàn)替代方法體系研究》項(xiàng)目。為實(shí)現(xiàn)該項(xiàng)目的研究目標(biāo)，由中檢院、廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局、廣東省疾病預(yù)防控制中心有關(guān)技術(shù)人員組成專家組，進(jìn)行了實(shí)地調(diào)研和座談，提出了我國(guó)《化妝品動(dòng)物試驗(yàn)替代方法體系研究》的研究報(bào)告。由廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心開(kāi)發(fā)的《采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方法》（申請(qǐng)?zhí)枺?00810029210.8），以及由廣東檢驗(yàn)檢疫局程樹(shù)軍等人開(kāi)發(fā)的《利用干細(xì)胞筏式培養(yǎng)制備毒性檢驗(yàn)用全層皮膚的方法》（申請(qǐng)?zhí)枺?00810030387.x）均獲得國(guó)家發(fā)明專利。

目前的報(bào)告都僅限于科學(xué)研究范疇，還沒(méi)有相應(yīng)的商品化產(chǎn)品及服務(wù)。2012年，北京富龍康泰生物技術(shù)有限公司的研究人員開(kāi)發(fā)出種商品化的3D重組皮膚模型，可用來(lái)評(píng)估化合物對(duì)于皮膚的刺激性或者腐蝕性。據(jù)目前所知，這是中國(guó)最早商品化的皮膚模型之，具有類似于人類表皮的組織結(jié)構(gòu)，且符合OECD的5條質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該皮膚模型培養(yǎng)在24孔板中，可以檢測(cè)所有劑型的化學(xué)物質(zhì)，包括粉劑、液體和膏劑；用MTT和IL-1α雙終點(diǎn)檢測(cè)有效提高皮膚刺激性試驗(yàn)和腐蝕性試驗(yàn)的靈敏度、特異性和精確性。

人造重組皮膚模型有望代替動(dòng)物模型，但是仍需要進(jìn)步完善。特別針對(duì)中國(guó)地區(qū)人群皮膚特點(diǎn)的皮膚模型和商業(yè)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)幾乎處于空白，研究者們?nèi)悦媾R巨大的挑戰(zhàn)。endprint