ACE及ACE2在慢性香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓對血管緊張素Ⅱ的調(diào)控作用

韓素霞 周彥梅 郭李平 常建梅 徐潔 馮磊

基礎(chǔ)研究

ACE及ACE2在慢性香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓對血管緊張素Ⅱ的調(diào)控作用

韓素霞 周彥梅 郭李平 常建梅 徐潔 馮磊

作者單位：830000 烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

目的 探討慢性香煙暴露誘導(dǎo)的肺動脈高壓形成過程中ACE、ACE2和血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的調(diào)控作用及特異性血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦的治療作用。方法 健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為 A 組：對照組（Con）；B 組：30 mg/kg單純氯沙坦組（30 mg/kg Los）；C 組：香煙誘導(dǎo)組（SM）；D 組：香煙誘導(dǎo)+10 mg/kg氯沙坦組（SM+10 mg/kg Los）；E 組：香煙誘導(dǎo)+30 mg/kg氯沙坦組（SM+30 mg/kg Los）。香煙暴露組和香煙暴露+氯沙坦組在標(biāo)準(zhǔn)毒理香煙暴露箱中接受被動吸煙；對照組同時在同種毒理箱中暴露于新鮮空氣；氯沙坦給藥采用每天腹腔內(nèi)注射；正常對照組給予等量生理鹽水注射。建立香煙誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型后，用插入導(dǎo)管法檢測右室收縮壓（RVSP）；Western blotting法分析ACE2和ACE的蛋白表達(dá)量；放射免疫分析試劑藥盒測定肺組織中的AngⅡ表達(dá)水平。結(jié)果 香煙暴露6個月后，慢性香煙暴露組大鼠RVSP較對照組明顯升高，大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)水平顯著增高。Western blotting結(jié)果顯示，ACE表達(dá)水平增高，香煙暴露組大鼠肺組織ACE2蛋白表達(dá)水平降低，而ACE蛋白表達(dá)水平較對照組升高。氯沙坦干預(yù)治療后，香煙暴露+氯沙坦組大鼠RVSP和AngⅡ較香煙暴露組降低（P＜0.05），肺組織ACE2蛋白表達(dá)水平較香煙暴露組增強(qiáng)，ACE蛋白表達(dá)水平較香煙暴露組減少（P＜0.05）。結(jié)論 慢性香煙暴露可導(dǎo)致肺動脈高壓，還可刺激肺組織ACE2和ACE的蛋白表達(dá)變化，提示ACE2和ACE在慢性香煙暴露誘導(dǎo)的肺動脈高壓中起一定作用。

香煙； 肺動脈高壓； 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶； 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2； 氯沙坦

肺動脈高壓是由多種原因引起的肺血管阻力增高，最終可導(dǎo)致右心室衰竭的一種疾病[1]。香煙煙霧作為改變肺血管的關(guān)鍵性作用因子，動物實驗證實慢性香煙暴露可引起肺實質(zhì)和氣道炎癥，誘導(dǎo)肺小血管及小氣道重構(gòu)，從而發(fā)生肺動脈高壓[2]。

研究報道肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)理中包含了RAS系統(tǒng)的激活。肺動脈高壓患者的肺動脈組織中ACE的表達(dá)增高[3]。從低氧含量和野百合堿處理的肺動脈高壓大鼠體內(nèi)觀測到RAS系統(tǒng)激活和AngⅡ表達(dá)水平升高[4]。低氧含量和野百合堿預(yù)處理條件下的肺動脈高壓大鼠，體內(nèi)AngⅡ和AngⅡ1型受體的表達(dá)增高[5]。此外，用ACEI或AT1R抑制劑治療可減輕低氧和野百合堿處理過的大鼠肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓，改善內(nèi)皮功能[6]。在RAS系統(tǒng)中，ACE的關(guān)鍵作用在于降解AngⅠ生成AngⅡ。ACE2為近年來才發(fā)現(xiàn)的RAS系統(tǒng)調(diào)節(jié)成員，主要作用是裂解AngⅡ生成Ang（1-7）。ACE和ACE2可能具有相反的生理作用，ACE2是組織RAS系統(tǒng)激活后特異性的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制[7，8]。ACE2已被證實與感染冠狀病毒所致的嚴(yán)重急性呼吸綜合征、急性肺損傷、肺纖維化和野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓等多種肺部疾病均有關(guān)聯(lián)[4]。最近的一項研究表明，AT1受體的降壓作用部分歸功于通過ACE2增加AngⅡ的代謝[6]。因此，本研究致力于檢測ACE2和ACE是否對慢性香煙誘導(dǎo)的肺動脈高壓起作用，進(jìn)一步探討慢性香煙煙霧誘導(dǎo)的肺動脈高壓的確切機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為A組：對照組（Con）；B組：30 mg/kg單純氯沙坦組（30 mg/kg Los）；C 組：香煙誘導(dǎo)組（SM）；D組：香煙誘導(dǎo)+10 mg/kg氯沙坦組（SM+10 mg/kg Los）；E組：香煙誘導(dǎo)加30 mg/kg氯沙坦組（SM+30 mg/kg Los）。

香煙暴露方案：香煙暴露模型組大鼠在標(biāo)準(zhǔn)毒理香煙暴露箱中接受被動吸煙，點燃15支香煙（每支含 14 mg焦油、1.0 g尼古?。?次/d，30 min/次；對照組同時在同種毒理箱中暴露于新鮮空氣；氯沙坦給藥采用每天腹腔內(nèi)注射；正常對照組給予等量生理鹽水注射，1次/d，共6個月。所有大鼠每天首次香煙煙霧暴露前30 min給予生理鹽水、10 mg/kg氯沙坦或30 mg/kg氯沙坦灌胃，1次/d。

1.2 肺動脈壓力測定及形態(tài)學(xué)分析 經(jīng)6個月觀察后，大鼠用戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，呼吸室內(nèi)空氣，暴露右側(cè)并做“V”型切口，肝素（50 U/ml）抗凝，插入硅膠管（0.45 mm ID，0.8 mm OD），經(jīng)右心房送入右心室，導(dǎo)管另一端連接P23×L壓力傳感器，經(jīng)載波放大器處理，用Gould-3400s/DASA4600型生理記錄儀器記錄。

所有大鼠檢測完右室收縮壓（RVSP）后，取肺組織。右肺組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋過夜，切片，組織學(xué)染色；左肺組織儲存于-80℃冰箱供生化分析使用。石蠟切片用ACE2鼠抗多克隆抗體（Santa Cruz）進(jìn)行免疫組化染色觀察ACE2的蛋白表達(dá)。用光學(xué)顯微鏡（H600，Nikon，Tokyo，Japan）配備放射性同位素動態(tài)數(shù)碼攝像機(jī)（Nikon，Tokyo，Japan）采集圖像。

1.3 放射免疫分析法測定肺組織AngⅡ含量AngⅡ放射免疫分析試劑藥盒（Beijing North Institute of Biological Technology，Beijing，China） 測定組織中的AngⅡ表達(dá)水平：肺組織用冰鹽水沖洗后切碎，于100℃的 0.1 M HCl中加熱10 min，勻漿。15 000×g離心分離30 min，上清液經(jīng)冷凍干燥后重新溶解于400 μl緩沖液中，其放射性活度由γ計數(shù)器測定。

1.4 Western Blot檢測心肌組織ACE2和ACE蛋白表達(dá)水平 用Western blotting法分析ACE2和ACE的蛋白表達(dá)量。肺組織勻漿后加入含50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，2 mM NaF，2 mM EDTA，0.1%SDS 和混合有蛋白酶抑制劑的組織裂解液（Roche Applied Sciece,Indianapolis，USA）。肺組織勻漿蛋白濃度用BCA法測定（Pierce,Rockford，IL，USA）。等量的蛋白樣本（30 μg）用10%的聚丙烯酰胺凝膠分離，后轉(zhuǎn)移至0.45 μM 聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，Bedford，MA）。膜分別置于1∶500稀釋的ACE2多克隆抗體中孵育（Santa Cruz Biotechnologies,Santa Cruz，CA）。Western blots參照說明書用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠RVSP增高 為證實慢性香煙煙霧和氯沙坦治療對大鼠肺動脈高壓的作用，我們檢測大鼠的血液動力情況。香煙暴露6個月大鼠的RVSP明顯上升（圖1），氯沙坦治療可明顯減少香煙誘導(dǎo)引起的RVSP增高，提示氯沙坦可能減輕由慢性香煙煙霧誘導(dǎo)的肺動脈高壓。

2.2 香煙煙霧暴露導(dǎo)致AngⅡ增高及氯沙坦的治療作用 為驗證香煙誘導(dǎo)的肺動脈高壓中是否存在AngⅡ水平增高，我們用放射免疫法檢測香煙暴露6個月后大鼠肺組織中AngⅡ的濃度。如圖2所示，慢性香煙暴露組大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)水平顯著增高，這一作用被氯沙坦治療顯著抑制（P＜0.05）。

圖1 香煙誘導(dǎo)的大鼠RVSP升高

圖2 香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺組織中AngⅡ的表達(dá)

2.3 香煙誘導(dǎo)的肺動脈高壓所致ACE升高、ACE2降低及氯沙坦的治療作用 為進(jìn)一步探討香煙誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠AngⅡ增高的機(jī)制，我們檢測香煙暴露組大鼠的ACE和ACE2表達(dá)水平。Western blotting法測定ACE和ACE2的蛋白表達(dá)，免疫組化染色檢測ACE2的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示，香煙暴露組大鼠與對照組大鼠相比，肺組織切片陽性染色顯示ACE2的表達(dá)顯著減少（圖3A）。Western blotting法光密度分析顯示，香煙暴露可顯著升高肺組織中ACE水平，減少ACE2的表達(dá)（圖3B和圖3C）。用ACE2抗體驗證了用氯沙坦治療大鼠可顯著升高ACE2表達(dá)水平，同時也發(fā)現(xiàn)香煙暴露組和香煙暴露+氯沙坦組的ACE表達(dá)水平降低。結(jié)果說明氯沙坦可在一定程度上逆轉(zhuǎn)香煙誘導(dǎo)的ACE2和ACE的表達(dá)。

3B western blotting法檢測肺組織中ACE2和ACE的蛋白表達(dá)。圖片分別代表3個獨立的實驗結(jié)果。

圖3 檢測大鼠肺組織中ACE2和ACE蛋白表達(dá)

3 討論

吸煙降低宿主防御的免疫反應(yīng)，吸煙介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可刺激促炎因子釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[9]。Selman等[10]認(rèn)為，吸煙可直接作用于血管系統(tǒng)，影響血管調(diào)節(jié)因子的釋放，從而調(diào)控血管收縮和舒張，血管平滑肌增殖，最終導(dǎo)致肺中、小動脈和微動脈重構(gòu)引起血管阻力增加和肺動脈壓力增高[4-6]。本研究主要證實了慢性香煙煙霧暴露顯著增加了大鼠的RVSP，經(jīng)氯沙坦治療顯著降低了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的RVSP升高。

有研究在香煙煙霧中暴露16周的大鼠體內(nèi)也觀察到平均肺動脈壓升高和肺血管肌化程度的增高[11]。本研究結(jié)果與以上研究一致，香煙暴露6個月可致大鼠RVSP顯著升高。綜上所述，慢性香煙煙霧可能會直接導(dǎo)致肺動脈重構(gòu)和肺動脈高壓。

近年來發(fā)現(xiàn)，人暴露于香煙煙霧的主要成分——尼古丁中，可致內(nèi)皮細(xì)胞中ACE的表達(dá)和活性都增加[12]。由于ACE在RAS系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，可將AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，香煙煙霧暴露可激活體內(nèi)RAS系統(tǒng)，升高AngⅡ含量。AngⅡ的主要生理和藥理作用是通過AT1受體介導(dǎo)的[13]，而AngⅡ已被證實通過與AT1受體結(jié)合在肺動脈高壓中起著重要的作用[14，15]。本研究提示，香煙誘導(dǎo)的肺動脈高壓也存在RAS系統(tǒng)的激活。我們發(fā)現(xiàn)與對照組大鼠相比，暴露于香煙煙霧中6個月的肺動脈高壓大鼠肺組織中ACE2的表達(dá)量降低，而ACE的表達(dá)量顯著增高，AngⅡ表達(dá)水平增加了將近1倍。

在RAS系統(tǒng)中，ACE分解AngⅠ生成強(qiáng)效血管收縮劑，ACE2水解AngⅠ生成負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白Ang（1-7）[7]。以往的研究中，Karram 等[16]發(fā)現(xiàn)氯沙坦治療對血壓正常大鼠血漿中ACE的蛋白表達(dá)有作用。一些實驗已證實，氯沙坦可高效地增加大鼠心肌或人類腎臟中ACE2的活性和蛋白表達(dá)量。增加ACE2可加快AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang（1-7），降低AngⅡ的濃度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，香煙暴露6個月的大鼠肺組織內(nèi)，ACE2蛋白表達(dá)顯著減少，肺動脈壓力明顯升高。

總之，慢性香煙煙霧暴露顯著誘導(dǎo)大鼠RVSP增高，肺組織AngⅡ水平和ACE蛋白表達(dá)升高和ACE2減少。氯沙坦治療可有效減少肺動脈高壓程度，逆轉(zhuǎn)肺組織AngⅡ水平增高和ACE蛋白高表達(dá)，使ACE2蛋白表達(dá)升高，說明氯沙坦減少香煙誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓程度，不僅可抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺組織中AngⅡ的作用，也可以減少AngⅡ的表達(dá)水平。ACE及ACE2通過調(diào)控AngⅡ在慢性香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓中發(fā)揮作用。

（本文圖3A第383頁）

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Effect of ACE and ACE2 on cigarette smoke-induced pulmonary hypertension in rat lungs

HAN Su-xia，ZHOU Yan-mei，GUO Li-ping，et al.Department of Cardiovasology，the Fifth Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China

Objective Cigarette smoking may induce pulmonary hypertension.The potential role of ACE2 and ACE in cigarette smoke-induced is yet unclear.Methods Rats were randomly divided into five groups：A：control，B：control plus losartan， C：smoke exposure only，D：smoke exposure plus+10 mg/kg losartan，E：smoke exposure plus+30 mg/kg losartan.The C and D groups were exposed to the smoke of 15 commercial cigarettes.After 6 months，right ventricle systolic pressure（RVSP），biochemical changes were examined.Results The RVSP and AngⅡwere raised and the level of lung tissue ACE2 was decreased in cigarette smoke-induced pulmonary hypertension in rats compared with that in control group.The RVSP and AngⅡwere reduced and ACE2 was increased as shown by inhibition with losartan.Conclusion This study demonstrated that ACE2 and ACE played an essential role in smoke-induced pulmonary hypertension.

Cigarette； Pulmonary hypertension； ACE2； ACE； Losatan

國家自然科學(xué)基金項目（項目編號：81060023）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.04.013

Q95-33；R543.2

A

1672-5301（2014）04-0330－04

2014-01-13）