術(shù)前希羅達(dá)化療對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)CK20mRNA的影響＊

秦鍇 賀長林 劉峰

（都江堰市人民醫(yī)院 四川都江堰 611830）

臨床流行病學(xué)資料顯示，早期可手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好，但仍有部分患者術(shù)后發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，術(shù)前探尋早期結(jié)直腸癌患者微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物及如何降低患者術(shù)前微轉(zhuǎn)移的發(fā)生成為了研究熱點(diǎn)［1］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者術(shù)前外周血CK20mRNA的水平并判斷術(shù)前口服希羅達(dá)是否對(duì)患者外周血CK20mRNA的相對(duì)含量產(chǎn)生影響，從而推測(cè)術(shù)前口服希羅達(dá)化療是否能降低患者術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［2］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 四川都江堰市人民醫(yī)院2011年10月至2013年10月收治的結(jié)直腸癌患者75例，隨機(jī)分為試驗(yàn)組38例和對(duì)照組37例。試驗(yàn)組男23例，女15例，平均年齡（45.5±10.6）歲，術(shù)后病理類型：中高分化腺癌13例，中分化15例，低分化10例；對(duì)照組男20例，女17例，年齡（42.3±11.1歲），術(shù)后病理類型高分化15例，中分化14例，低分化8例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩組患者的年齡、性別、腫瘤分期等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。

1.2 儀器試劑

1.2.1 儀器 ABI PRISM7000real－time PCR 反應(yīng)儀（購自美國ABI公司）；恒溫水浴鍋（購自美國GRANT公司）；普通離心機(jī)（購自美國Beckman公司。

1.2.2 試劑材料 RNA提取試劑盒（購自TAGENG公司）；CK20mRNA熒光定量PCR試劑盒（上海久盛醫(yī)療用品有限公司）。CK20mRNA上游引物：5′－CAGGCACACGGT－GAACTATGG－3′，下 游： 5′－GATCAGCTTCCACTGTTAGCG－3′。cDNA反轉(zhuǎn)錄采用oligoDT方法對(duì)全基因組mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成Cdna，所有引物序列由TAKARA大連寶生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 試驗(yàn)組術(shù)前每天希羅達(dá)2500 mg／m2，兩次口服，共1周，對(duì)照組為進(jìn)行術(shù)前輔助化療。于患者術(shù)晨抽取外周靜脈血10mL進(jìn)行檢測(cè)血漿循環(huán)采CK20mRNA。

1.3.2 RNA提取劑real－time PCR 根據(jù)全基組RNA提取試劑盒操作說明，提取兩組患者外周血總RNA，然后根據(jù)TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并檢測(cè)cDNA濃度。根據(jù)real－timePCR熒光定量試劑盒操作說明，對(duì)上述兩組患者cDNA中的CK20mRNA進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷CK20mRNA相對(duì)含量及陽性率（圖1）。

圖1 CK20mRN實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及溶解曲線

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2或fisher確切概率法比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周CK20mRNA陽性率比較 試驗(yàn)組38例患者希羅達(dá)口服1周后外周血CK20mRNA檢測(cè)陽性21例（55%），對(duì)照組CK20mRNA檢測(cè)陽性35例（95%），試驗(yàn)組CK20mRNA陽性率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 兩組陽性患者CK20mRNA相對(duì)含量比較試驗(yàn)組CK20mRNA陽性患者其CK20mRNA相對(duì)換量為0.13±0.08，顯著低于對(duì)照組0.78±0.22（P＜0.05）圖2。

圖2 兩組患者CK20mRNA相對(duì)含量比較

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國常見消化道腫瘤，臨床上較為常見，早期接受手術(shù)治療患者預(yù)后較好，但晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差，5年生存率較低［3］。但臨床流行病學(xué)資料顯示，部分早期患者術(shù)后仍然發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此提示臨床分期為早期的結(jié)直腸癌患者在進(jìn)行手術(shù)時(shí)可能已經(jīng)發(fā)生了微轉(zhuǎn)移［4、5］。術(shù)前或術(shù)中發(fā)生微轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后不良的重要原因之一。因此，術(shù)前探尋早期結(jié)直腸癌患者微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物成為了研究熱點(diǎn)。CK源于上皮細(xì)胞，包括至少20種相關(guān)基因多肽家族，是上皮細(xì)胞分化的標(biāo)記物，臨床研究顯示，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者血清CK20的水平顯著升高，被認(rèn)為是檢測(cè)癌細(xì)胞循環(huán)的敏感標(biāo)記物。CK20是一種新發(fā)現(xiàn)的多肽，局限在胃腸上皮細(xì)胞具有嚴(yán)格組織特異性，幾乎在所有大腸癌中都明顯表達(dá)。我們推測(cè)，用編碼CK20蛋白的CK20mRNA作為CK20蛋白的上游表達(dá)產(chǎn)物，應(yīng)與CK20在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌微轉(zhuǎn)移方面具有同樣效果，且其為CK20的編碼基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，應(yīng)在判斷的敏感性和特異性方面更優(yōu)于 CK20［6，5］。因此，本研究采用real－timePCR的方法對(duì)我院收治的75例早期接受手術(shù)的結(jié)直腸癌患者進(jìn)外周血CK20mRNA水平檢測(cè)，并根據(jù)是否術(shù)前應(yīng)用希羅達(dá)口服化療分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，判斷希羅達(dá)術(shù)前口服化療對(duì)患者外周血CK20mRNA表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組CK20mRNA陽性率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)組 CK20mRNA 陽性患者其CK20mRNA相含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果提示，結(jié)直腸癌患者術(shù)前口服希羅達(dá)可顯著降低患者外周血CK20mRNA陽性率及拷貝數(shù)。

本研究中采用術(shù)前希羅達(dá)口服化療，降低了患者外周血CK20mRNA的表達(dá)水平，因而可能在一定程度上減低患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但由該研究部分?jǐn)?shù)據(jù)尚未獲得，無法對(duì)兩組患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及生存率進(jìn)行完整統(tǒng)計(jì)，因而希羅達(dá)術(shù)前口服化療是否降低腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及延長患者生存時(shí)間有待進(jìn)一步研究。

［1］Ricardi U，Racca P，F(xiàn)ranco P，et al.Prospective phase II trial of neoadjuvant chemo－radiotherapy with Oxaliplatin and Capecitabine in locally advanced rectal cancer（XELOXART）［J］.Medical oncology，2013，30（2）：581.

［2］Al－Gahmi AM，Kerr IG，Zekri JM，et al.Capecitabine－induced terminal ileitis［J］.Ann Saudi Med，2012，32（6）：661－662.

［3］張健.希羅達(dá)與奧沙利鉑治療中晚期結(jié)腸癌的療效分析與評(píng)價(jià)［J］.臨床合理用藥雜志，2011，04（36）：53.

［4］Matsuda C，Tamagawa H，Nishikawa K，et al.Study of tolerability of capecitabine in postoperative adjuvant chemotherapy in colon cancer［J］.Cancer ＆chemotherapy，2013，40（3）：327－330.

［5］Schmiegel W，Reinacher－Schick A，Arnold D，et al.Capecitabine／irinotecan or capecitabine／oxaliplatin in combination with bevacizumab is effective and safe as first－line therapy for metastatic colorectal cancer：a randomized phase II study of the AIO colorectal study group［J］.Annals of oncology：official journal of the European Society for Medical Oncology／ESMO，2013，24（6）：1580－1587.

［6］Kim KP，Kim HS，Sym SJ，et al.A UGT1A1＊28 and ＊6genotype－directed phase I dose－escalation trial of irinotecan with fixed－dose capecitabine in Korean patients with metastatic colorectal cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2013，71（6）：1609－1617.