鮑氏不動桿菌在鼻咽癌放療醫(yī)院感染中的同源性分析

李傳杰 （梧州市紅十字會醫(yī)院感染科，廣西 梧州 543002）

陶建萍 （梧州市紅十字會醫(yī)院微生物室，廣西 梧州 533000）

李軍 （梧州市紅十字會醫(yī)院分子微生物室，廣西 梧州 543002）

高建全，梁錦輝 （梧州市紅十字會醫(yī)院放療科，廣西 梧州 54300）

鮑氏不動桿菌 （AB）是鼻咽癌放射醫(yī)院感染的重要病原菌，準(zhǔn)確的種屬鑒定和基因分型對預(yù)防和控制感染非常重要［1－3］。為了解鼻咽癌放療AB醫(yī)院感染的同源性，本研究采用隨機擴增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)對鼻咽癌住院放療患者臨床分離的AB進行基因分型同源性分析?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 AB分離株來源于2013年1月至12月本院4個放療病區(qū)鼻咽癌住院放療醫(yī)院感染的臨床標(biāo)本。其中男40例，年齡20～71歲，平均50歲；女3例，年齡48～61歲，平均50歲。每位患者均發(fā)生不同程度醫(yī)院感染，其中有10株分離自4例病人在不同住院時間的相同部位。

1.1.2 儀器和試劑 BD phoenix 100全自動微生物鑒定藥敏系統(tǒng)；ABI 9700PCR儀，DYY－6C型電泳儀 （北京六一儀器廠），Centrifuge 5415D離心機 （Eppendorf公司），凝膠成像系統(tǒng) （Kodark Elctrophoresis Documentation and Analysis System 120＋），ABI 3900DNA合成儀；DNA提取試劑QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit（Qiagen公司），Taq PCR （Qiagen公司），引物 （英濰捷基公司）。

1.2 方法

1.2.1 鑒定和藥敏 采用BD phoenix 100全自動微生物鑒定藥敏系統(tǒng)對臨床分離菌株進行鑒定和藥敏實驗，參照CLSI M100－S23推薦的抗菌藥物藥敏試驗分組原則選擇7類14種代表性藥物進行耐藥性分析。

1.2.2 RAPD操作 應(yīng)用RAPD技術(shù)對臨床分離菌進行分子生物學(xué)基因分型［4－5］，引物序列為：ABFR1：GCTTGTGAAC。DNA提?。簩⒕?.5ml置于Eppendorf管經(jīng)多次孵育、振蕩、離心，提取DNA溶液備用。反應(yīng)條件：93℃2min；92℃30s，40℃1min，72℃3min，34Cycles；92℃30s；40℃1min；72℃10min。產(chǎn)物檢測：取擴增產(chǎn)物5μl與1μl Loading buffer充分混勻，于2%瓊脂糖凝膠、170V電壓電泳40min；使用紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

1.2.3 基因分型 用Cross Checker軟件對條帶進行識別，自動識別錯誤的條帶用手工識別調(diào)整，形成NTS文件。將NTS文件導(dǎo)入NTSYSpc 2.0軟件模擬計算遺傳距離，選擇 “SAHN”功能做聚類分析，生成親緣關(guān)系樹狀圖。DNA基因型別同源性判斷以每一分離物的所有可見帶具有相同的移動距離定為同一型 ，帶的形狀移動的距離不同或所有可見帶的移動距離相同但缺少兩條帶以上定為另一型。各個菌株的擴增電泳條帶數(shù)目和移動完全相同者，表示這些菌株之間高度同源。

2 結(jié)果

2.1 臨床分布

37例感染患者臨床標(biāo)本分離出43株AB，其中咽拭子24株 （55.81%）、痰13株 （30.23%）、口腔分泌物5株 （11.63%）、血液1株 （2.33%），臨床分布為放療一區(qū)5株 （11.63%）、二區(qū)20株（46.51%）、三區(qū)7株 （16.28%）、四區(qū)11株 （25.58%）。

2.2 耐藥性

43株AB對14種代表性抗菌藥物全部敏感占13.95%，單獨哌拉西林耐藥占9.30%，單獨慶大霉素耐藥占4.65%，泛耐藥占18.60%，其中：氨芐西林／舒巴坦耐藥率30.23%、哌拉西林62.09%、哌拉西林／他唑巴坦34.88%、頭孢他啶32.56%、頭孢曲松60.47%、頭孢吡肟37.21%、亞胺培南18.60%、美羅培南18.60%、慶大霉素29.53%、阿米卡星20.83%、環(huán)丙沙星27.91%、左氧氟沙星25.58%、四環(huán)素34.92%、復(fù)方新諾明32.56%。

2.3 基因型別

43份AB樣本擴增電泳出38個圖譜，分16個基因型別，其中I型17株占44.74% （8、11、12、15、16、19、21、23、24、25、29、31、34、37、38、39、40號樣本），A型4株（1、2、18、20號樣本），E型2株 （6、35號樣本），G型2株 （9、10樣本），H 型2株（13、30號樣本）；其他型別各1株；未擴增出條帶5株 （22、26、27、36、42號樣本）。

2.4 同源性分析

不同型別分離菌在各病區(qū)散在分布，I型分離菌主要分離自咽拭子標(biāo)本 （39.53%），75.0%的泛耐藥株同為I型，單獨慶大霉素耐藥AB（2株）同為A型，見圖1、表1。相同病人在不同時期感染分離株的型別無密切親緣關(guān)系。

圖1 16個不同型別AB親緣關(guān)系樹狀圖

3 討論

放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，也是誘發(fā)鼻咽癌AB醫(yī)院感染的高危因素。我市及周邊地區(qū)是世界鼻咽癌高發(fā)區(qū)，放療相關(guān)醫(yī)院感染率高達79.33%［1］。多重耐藥的AB幾乎對所有頭孢菌素、氨曲南、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物均高度耐藥［6］，而且容易在不同病區(qū)、不同感染個體、感染部位之間交叉感染傳播，臨床治療和防控十分棘手［7－8］。準(zhǔn)確的種屬鑒定和基因分型對感染源和傳播途徑的追蹤、耐藥菌監(jiān)測、感染的診斷和治療有較好的指導(dǎo)作用［3，5，9］。

本組資料中AB在咽拭子、口腔分泌物等口咽部感染標(biāo)本的構(gòu)成比高達67.44%，與羅晉卿、張錦林等文獻報道基本一致［1，10］。對7類14種代表性抗菌藥物的耐藥率除哌拉西林和慶大霉素外都低于40%，說明我院近期在臨床治療鼻咽癌AB感染時的抗菌藥物選擇壓力尚可。RAPD基因分型結(jié)果顯示：不同型別感染菌的病區(qū)分布散在，75%的泛耐藥株均同屬于Ⅰ型，揭示耐藥的出現(xiàn)應(yīng)與患者本身疾病嚴(yán)重程度、放療強度以及抗菌藥物使用等因素有關(guān)，但不排除耐藥菌病區(qū)之間交叉?zhèn)鞑サ目赡苄?。高耐藥的Ⅰ型在咽拭子?biāo)本的高分布 （39.53%）可能與鼻咽癌患者的口咽部放療損傷和泛耐藥感染菌的難治性等相關(guān)。相同病人在不同時期多次感染分離株無密切親緣關(guān)系，提示病區(qū)環(huán)境廣泛存在的AB可在鼻咽癌放療后抗感染能力下降的情況下反復(fù)，條件致病。

表1 38株不同型別AB臨床分布

研究結(jié)果表明，本組資料AB對多種抗菌藥物保持較好敏感性，臨床治療鼻咽癌AB感染時的抗菌藥物選擇壓力不大。同型別菌株的耐藥表型相近，但單獨泛耐藥表型及單一抗菌藥物耐藥表型的菌株之間基因同型不能確定交叉感染的存在。不同感染部位標(biāo)本分離株之間同源性不明顯，抗感染能力低下的鼻咽癌放療患者容易反復(fù)感染同種非同源的AB。合理運用RAPD基因分型技術(shù)開展鼻咽癌放療等醫(yī)院感染危險因素及感染菌同源性研究，對強化和改進感染防控措施，減少耐藥菌的產(chǎn)生和播散十分重要。

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