Livin和PTEN基因在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)性的研究

黃方名 王文忠 李東海

現(xiàn)在惡性腫瘤對(duì)人類的威脅日益突出，目前腫瘤已成為目前死亡常見(jiàn)原因之一。在中國(guó)，頭頸癌的發(fā)病率在10%左右，其中喉癌占頭頸癌的13.9%，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，近年來(lái)喉癌的發(fā)病率有明顯增高的趨勢(shì)。其病理類型以鱗狀細(xì)胞癌為主，占93%～98%，男性較女性多見(jiàn)，約為7～10∶1，年齡以40～60歲最多。由于其原發(fā)灶部位特殊、隱蔽，臨床上又與患者呼吸、吞咽、發(fā)音等重要生理活動(dòng)密切相關(guān)，因此給腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、治療和患者預(yù)后帶來(lái)了挑戰(zhàn)[1]。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

62例喉癌患者均為蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及我院2008年6月-2012年12月收治的且病歷資料完整的喉鱗狀細(xì)胞癌患者，并且在術(shù)前未行相關(guān)的放、化療。男性58例，女性4例，年齡52～70歲，平均58.2歲，>55歲組42例，≤55歲組20例。標(biāo)本分為喉癌組(喉原發(fā)鱗狀細(xì)胞癌)62例和癌旁組18例(癌旁1.0～2.0 cm，術(shù)后病理檢查證實(shí)為正常喉組織)。臨床TNM分期按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)2002年標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期7例，Ⅱ期19例，Ⅲ期29例，Ⅳ期7例。腫瘤原發(fā)于聲門上型26例，聲門型32例，聲門下型4例。病理組織學(xué)分化程度：Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)37例，Ⅲ級(jí)6例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期：N0期39例、N1期20例、N2期3例；所有患者未見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 標(biāo)本采集

標(biāo)本均取自蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科收集的喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常喉組織(術(shù)后病理檢查證實(shí))石蠟包埋標(biāo)本。所有標(biāo)本離體后均用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋。每例標(biāo)本連續(xù)切4 μm厚，供HE染色及免疫組化使用。

1.3 試劑與方法

兔抗人Livin多克隆抗體(北京中杉生物工程有限公司)；鼠抗人PTEN單克隆抗體(clone 6H2.1 美國(guó)Dako North公司)；S-P-plus-kit (鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶免疫組化試劑盒)。采用免疫組化法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS17.0 for Windows軟件包處理，根據(jù)資料性質(zhì)采用χ2檢驗(yàn)、兩個(gè)獨(dú)立樣本的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、相關(guān)分析Spearman秩和相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin蛋白在LSCC和癌旁喉組織中的表達(dá)

62例LSCC中l(wèi)ivin陽(yáng)性表達(dá)35例，陽(yáng)性表達(dá)率為72.58%。癌旁喉組織中l(wèi)ivin染色主要定位于骨骼肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核。18例癌旁喉組織中無(wú)livin陽(yáng)性表達(dá)者，兩組比較，差異具有顯著性(P<0.05) (表1)。

表1 Livin基因在LSCC和癌旁喉組織中的表達(dá)情況/例

2.2 Livin表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系

Livin陽(yáng)性表達(dá)率隨LSCC病理分級(jí)、 臨床分期的升高而升高。Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)LSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率分別為47.40%、81.10%、100.00%。TNM分期(UICC，2002)Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期中其陽(yáng)性表達(dá)率分別為42.90%、63.20%、79.30%、100.00%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級(jí)N0、N1、N2LSCC中其表達(dá)陽(yáng)性率分別為59.00%、95.00%、100.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聲門型、聲門上型、聲門下型LSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.00%、69.20%、75.00%，三者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；男性LSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率為74.1%，女性為50.00%，兩者比較差異無(wú)顯著性(χ2=1.114，P>0.05)；年齡≤55歲者其陽(yáng)性表達(dá)率為65.00%，>55歲者其陽(yáng)性表達(dá)率為76.20%，兩者比較差異無(wú)顯著性(χ2=1.102，P>0.05)(表2)。

2.3 PTEN在LSCC和癌旁喉組織中的表達(dá)

62例LSCC中PTEN陽(yáng)性表達(dá)37例，陽(yáng)性表達(dá)率為59.70%，18例癌旁喉組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)17例，陽(yáng)性表達(dá)率為94.40%，兩者比較，差異具有顯著性(P<0.05)(表3)。

表2 Livin表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系/例

表3 PTEN在LSCC和癌旁喉組織中的表達(dá)/例

2.4 PTEN表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系

Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)LSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.90%、54.10%、33.30%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期LSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.70%、84.20%、44.80%、29.60%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0、N1、N2LSCC中其表達(dá)陽(yáng)性率分別為71.80%、40.00%、33.30%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聲門型、聲門上型、聲門下型LSCC中其陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.20%、61.50%、75.00%，三者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；男性LSCC患者中其陽(yáng)性表達(dá)率為61.30%，女性為50.00%，兩者間差異無(wú)顯著性(χ2=0.178，P>0.05)；年齡>55歲者其陽(yáng)性表達(dá)率為59.50%，≤55歲者其陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%，兩者間差異無(wú)顯著性(χ2=0.133，P>0.05)(表4)。

表4 PTEN表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系/例

2.5 Livin與PTEN表達(dá)的相關(guān)性

62例LSCC組織中l(wèi)ivin基因表達(dá)陽(yáng)性45例，PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性37例；livin基因表達(dá)陽(yáng)性而PTEN基因表達(dá)陰性22例；livin基因表達(dá)陰性而PTEN基因表達(dá)陽(yáng)性14例；livin和PTEN基因表達(dá)均為陽(yáng)性23例；livin和PTEN基因表達(dá)均為陰性3例，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(γs=-0.382，P<0.01)(表5)。

表5 Livin與PTEN表達(dá)的相關(guān)性/例

3 討論

喉癌是喉部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率目前有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。喉癌的發(fā)病率地區(qū)差別也很大，東北地區(qū)發(fā)病率最高，占全身惡性腫瘤5.7%～7.6%，占耳鼻喉惡性腫瘤的7.9%～35%。在我國(guó)部分省市的發(fā)病率約為1.5～3.4/10萬(wàn)人，近年來(lái)喉癌的發(fā)病率有明顯增加的趨勢(shì)。其病理類型以鱗狀細(xì)胞癌為主，占96%～98%，男性較女性多見(jiàn)，約為7～10∶1，以40～60歲最多。

Livin是最新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)中的新成員之一，是從人類基因組cDNA文庫(kù)中克隆得到的1種蛋白質(zhì)，特異性表達(dá)于人的胚胎組織及大多數(shù)人實(shí)體瘤細(xì)胞和組織，研究表明其Livin抗凋亡功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于Bcl-2家族。人類IAP家族的存在,使腫瘤細(xì)胞對(duì)缺血缺氧、放化療等作用產(chǎn)生耐受,從而使腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)生長(zhǎng)，而且livin是1種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子,以其為靶點(diǎn)的抑制物及反義Livin能夠不僅保護(hù)細(xì)胞不凋亡，而且具有廣譜和低毒的副作用，為腫瘤的基因診斷和治療提供了新的研究途徑。Livin 基因位于人第20號(hào)染色體q13.3上,全長(zhǎng)46kb,包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。與IAP 家族其它成員相似,Livin 也包含1個(gè)串聯(lián)的含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IAP 重復(fù)區(qū)(baculoviral IAP re-peat,BIR)和相鄰的羧基末端含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)。Livin的抗凋亡活性就主要依賴于其BIR和RNG的結(jié)構(gòu)域。Livin在正常成人的大多數(shù)終末分化組織中低表達(dá)或不表達(dá)，相關(guān)研究表明Livin基因大多數(shù)惡性腫瘤中能呈高表達(dá)如黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病淋巴瘤以及非小細(xì)胞肺癌等。Livin 與Caspases 作用的途徑： Livin通過(guò)抑制Caspase 的活性，而導(dǎo)致多種途徑的細(xì)胞凋亡，另外有相關(guān)報(bào)道Livin 抑制caspases 活性的作用的發(fā)揮主要是由BIR 結(jié)構(gòu)域來(lái)完成的，它是與caspases 蛋白結(jié)合的部位,阻止caspase蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能。Livin 與TAK1/JNK1 途徑： Livin 基因可激活MAP ( mitogen - activated protein) 激酶JNK1和JNK2,對(duì)JNK3 無(wú)激活作用。對(duì)JNK1的激活作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于JNK2,并且是Livin 對(duì)抗TN F-α和ICE介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的一條重要途徑。其它途徑： 也有相當(dāng)一部分IAPs 通過(guò)與BIR 結(jié)構(gòu)域和TNF受體結(jié)合，沿TNFR1- Tradd- Fadd 途徑激活procaspase- 8，從而激活caspase- 3,達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)：IAPs 還可以通過(guò)誘導(dǎo)NF- kB 能激活A(yù)kt (絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶) 途徑、 鈣離子結(jié)合蛋白等方式發(fā)揮其抗凋亡作用。

凋亡抑制是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)普遍特性，IAP家族作為細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑，正日益成為人們關(guān)注的癌癥治療的靶點(diǎn)。為惡性腫瘤的基因診斷提供了一定的理論依據(jù)。Liu等[2]也證實(shí)Livin-α在膀胱癌復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)明顯高于原發(fā)患者，同時(shí)2年隨訪結(jié)果顯示Livin陰性患者比陽(yáng)性患者復(fù)發(fā)率降低31%，因此Livin還可以作為監(jiān)測(cè)膀胱癌早期復(fù)發(fā)及預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志。Liu等[3]發(fā)現(xiàn)反義Livin低核苷酸可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)半胱氨酸天冬氨酸的蛋白激酶-3來(lái)實(shí)現(xiàn)的，說(shuō)明Livin在膀胱癌抑制其凋亡發(fā)生。Hariu等[4]檢測(cè)Livin可在許多肺癌細(xì)胞株和原發(fā)性肺癌組織中呈異常表達(dá),而在正常的肺組織中卻未見(jiàn)表達(dá)。Tanabe等[5]用RT-PCR方法檢測(cè)了38例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織及15例非癌肺組織，前者的Livin陽(yáng)性表達(dá)率為76.3%，顯著高于后者，其中早期肺癌的陽(yáng)性表達(dá)率為74.2%。Wang[6]的研究表明 檢測(cè)凋亡蛋白抑制劑，在非小細(xì)胞肺癌圍手術(shù)期患者血清進(jìn)行了分析趨勢(shì)來(lái)探討非小細(xì)胞肺癌的診斷、分期及預(yù)后判斷的臨床意義，結(jié)果表明Livin的量和凋亡抑制劑的量呈反向關(guān)系。

PTEN(phosphatase and tensin homology deletedon chromosome 10)是目前人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸化酶功能的抑癌基因，作為磷酸肌醇-3激酶(PI3-K)/絲-蘇氨酸激酶(AKT)通路的負(fù)調(diào)控因子，PTEN-PI3K-Akt通路在細(xì)胞整合外界刺激的反應(yīng)中處于核心地位，PTEN功能的缺失與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。PTEN基因所編碼蛋白的主要功能是參與細(xì)胞增殖和凋亡中所發(fā)生的去磷酸化作用，這也是PTEN基因抑癌作用的基礎(chǔ)。PTEN基因正常表達(dá)可以抑制細(xì)胞的惡變，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)，該基因異常將導(dǎo)致蛋白表達(dá)下降從而失去抑癌作用。

PTEN定位于染色體10q23，基因全長(zhǎng)為200 kb，共403個(gè)氨基酸，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，序列分析顯示其氨基酸端區(qū)包含有PTP和雙特異磷酸酯酶。由N端180個(gè)氨基酸的催化區(qū)，中部165個(gè)氨基酸的C2區(qū)和C端50個(gè)氨基酸的尾區(qū)組成。研究PTEN蛋白的晶體結(jié)構(gòu)表明，它有2個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：N-端功能區(qū)(磷酸酶結(jié)構(gòu)域)其活性位點(diǎn)是突變熱點(diǎn)。C-端含脂質(zhì)結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的PEST結(jié)構(gòu)域和蛋白間相互起作用的PDZ結(jié)構(gòu)域。其中C2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)和脂類的結(jié)合及蛋白質(zhì)的膜定位，PDZ結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)PTEN的磷酸酶活性，增強(qiáng)PTEN信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[7]。

PTEN的作用機(jī)制有以下幾個(gè)途徑：① PTEN促進(jìn)細(xì)胞凋亡。首先，它阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C，并使AKt調(diào)節(jié)叉頭(Forkhead)轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)磷酸化失活，而這兩個(gè)因子所誘導(dǎo)的基因(如Fas配體基因)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡極為重要。其次AKt使原凋亡因子BAD(Bcl-2家族成員)和半胱天冬蛋白酶-9(caspase)磷酸化而失活。另有相關(guān)研究報(bào)道，PI3K/AKt對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-KB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及CD-95/Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞有拮抗作用[8]?？梢?jiàn)，PI3K/AKt通路的激活，抑制了細(xì)胞凋亡，刺激了細(xì)胞生長(zhǎng)。而PTEN基因具有雙特異性磷酸活性，能使PIP3去磷酸化形成PIP2，維持了PIP3低水平，阻斷了PI3K/AKt通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。②PTEN誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯：PTEN具有雙磷酸脂酶特性，它激活PI3K使PIP3脫磷酸化，阻止PI3K調(diào)控的生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，維持細(xì)胞在正常的生長(zhǎng)周期中的生長(zhǎng)[9]。

PTEN蛋白具有多種生物學(xué)功能，通過(guò)其磷酸酶活性調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、黏附和遷移。是繼P53后另一個(gè)廣泛的與腫瘤關(guān)系密切的抑癌基因，在人類多種惡性腫瘤中都存在PTEN基因的異常表達(dá)，主要通過(guò)基因突變、缺失或者甲基化而失活[10]。PTEN蛋白在胞質(zhì)中表現(xiàn)出雙重特異性磷酸酶活性，在細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞遷延過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Livin和PTEN在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果一致。這對(duì)基因的可能的作用機(jī)制，Livin和PTEN均參加細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡，兩者作用環(huán)節(jié)一致，但生物學(xué)效應(yīng)相反，在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，隨著腫瘤惡性程度加重，Livin表達(dá)增高，而PTEN表達(dá)減低，Livin的表達(dá)受PI3K/AKt(磷脂酰肌醇3激酶)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，而PTEN是PI3K/AKt通路的上游基因，對(duì)PI3K/AKt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)有調(diào)控作用。作為磷酸脂酶的PTEN在正常情況下抑制了PI3K/AKt通路，從而抑制Livin的表達(dá)，但組織發(fā)生惡變，PTEN表達(dá)下調(diào)或者缺失，其對(duì)PI3K/AK通路的抑制作用消弱，Livin表達(dá)上調(diào)，一方面啟動(dòng)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分裂，另一方面進(jìn)入細(xì)胞核與CDK4(細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶)結(jié)合抑制凋亡。PTEN可使第二信使PIP3去磷酸化，轉(zhuǎn)變成PIP2，阻斷其下游AKt激酶的活化，進(jìn)而阻斷相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，Livin和PTEN基因在LSCC中的異常表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系尚需大樣本的實(shí)驗(yàn)研究；兩者在LSCC中可能存在的相關(guān)性及在LSCC形成及發(fā)生發(fā)展過(guò)程中相互作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。

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