二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體在錳轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用

焦翼飛，李濤，曾水林

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，江蘇 南京 210009)

二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(divalent metal-ion transporter-1，DMT1)是一種在哺乳動物中廣泛表達(dá)的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與機(jī)體內(nèi)多種金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)(以鐵和錳為主)。相關(guān)研究已證實(shí)，金屬離子、氧化還原物質(zhì)、炎癥反應(yīng)等因素均可影響DMT1基因的表達(dá)。DMT1還可能與腦內(nèi)神經(jīng)元變性有關(guān)。深入研究DMT1將為了解金屬離子代謝及其相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供重要的研究資料。正常生理?xiàng)l件下，錳(Mn)是機(jī)體必需的金屬元素，對維持大腦正常功能起到重要作用。Mn過多或缺乏會對機(jī)體產(chǎn)生有害的影響。Mn能選擇性蓄積在腦內(nèi)，作用于錐體外系，因此，Mn中毒可引起類帕金森癥狀。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)室在研究細(xì)胞(尤其是神經(jīng)元)攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)Mn的機(jī)制，結(jié)果顯示DMT1在Mn轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能起著至關(guān)重要的作用。

1 二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體

二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體又稱為自然抵抗相關(guān)巨噬蛋白2(natural resisitance associated macrophage protein 2，Nramp2)，或二價(jià)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(divalent cation transporter 1，DCT1)，屬于可溶性載體家族成員(solute carrier family 11member 2，SLC11A2)，是哺乳動物體內(nèi)質(zhì)子偶聯(lián)的跨膜金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。它于1995年首次被發(fā)現(xiàn)，因與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Nramp1基因同源性高達(dá)78%，所以被命名為Nramp2[1]。自發(fā)現(xiàn)DMT1以來，在它的結(jié)構(gòu)、分布、功能等方面研究已經(jīng)獲得很多重要進(jìn)展，對于DMT1的研究已經(jīng)成為整個微量元素研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)問題。

1.1 DMT1分子的結(jié)構(gòu)

DMT1分子量為61456，等電點(diǎn)(isoionic point，pI)為6.02，是具有12個跨膜結(jié)構(gòu)域(transmemberane，TM)的糖蛋白，其糖基化的細(xì)胞外袢狀結(jié)構(gòu)和高度保守的細(xì)胞內(nèi)序列都具有高度的疏水性。DMT1信使核糖核苷酸(mRNA)的4種亞型在不同組織和細(xì)胞編碼4種不同的DMT1蛋白并行使不同的功能。其中的2個在最后1個外顯子中含有IRE(iron-responsive element)序列，其他2個則沒有；因此C末端DMT1蛋白亞型被分為Ⅰ(+IRE)和Ⅱ(-IRE)。人DMT1基因組DNA含有43 999個堿基，包括16個外顯子，其cDNA有4 142個堿基，所編碼蛋白含561個氨基酸，其羧基端和氨基端都位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。DMT1與同家族Nramp1的基因同源性高達(dá)78%，氨基酸相似性達(dá)到64%，二者的主要區(qū)別在于氨基端的不同[2]。Lee等[3]研究發(fā)現(xiàn)與Nramp1基因相比，DMT1在氨基端多出1個外顯子和內(nèi)含子1，并在羧基端多出了外顯子17和內(nèi)含子16，故推測兩者在結(jié)構(gòu)和功能上的差別可能與此有關(guān)。

1.2 DMT1分子的分布

DMT1在體內(nèi)的表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性，且不同的亞型在各個器官的表達(dá)和功能上都有所不同。DMT1亞型在成人組織中普遍存在，而DMT1(+IRE)和DMT1(-IRE)卻具有細(xì)胞型特異性和亞細(xì)胞分布特異性。相關(guān)研究表明，在胚胎組織中DMT1(+IRE)和DMT1(-IRE)的表達(dá)是普遍存在的，并且兩種亞型的蛋白都集中在胚胎上皮細(xì)胞膜上，這與所在組織的吸收或排泄功能相關(guān)。其中，DMT1(-IRE)存在于神經(jīng)元、神經(jīng)樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，而DMT1(+IRE)主要存在于在這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[4]。

1.3 DMT1分子的功能

DMT1的生物學(xué)效應(yīng)的首次發(fā)現(xiàn)是基于對兩種動物模型[microcytic(mk) mice和Belgrade(b/b) rats]的表型分析，它們發(fā)生了自發(fā)的突變導(dǎo)致，DMT1基因的第4個跨膜結(jié)構(gòu)域的第185號殘基從甘氨酸突變成精氨酸[5]。兩種動物都表現(xiàn)出小紅細(xì)胞性貧血，這和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體的破壞有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致了體內(nèi)錳的失衡。類似的，人類含有不同區(qū)域突變的DMT1,如E399D[6]、R416C[7]或者G212V[8]也都表現(xiàn)出小紅細(xì)胞性貧血，這提示我們DMT1在哺乳類動物中功能上可能的共性。

Salazar等[9]對帕金森(PD)患者死后的腦組織行免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),在其黑質(zhì)(SN)中DMT1的表達(dá)量增加;在MPTP染毒的小鼠腹側(cè)中腦發(fā)現(xiàn)DMT1+IRE表達(dá)量上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)含有DMT1突變體的小鼠有部分的抗MPTP毒性的神經(jīng)保護(hù)功能。陳瑛等[10]用乳胞素誘導(dǎo)神經(jīng)元(SH-SY5Y)細(xì)胞系的損傷進(jìn)而檢測DMT1表達(dá)量的改變時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳胞素處理組DMT1的表達(dá)量明顯增加。這提示我們，DMT1可能和腦以及神經(jīng)元的損傷有密切的關(guān)系。

現(xiàn)階段，有兩種理論來解釋DMT1發(fā)揮功能的機(jī)制：(1) 不依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)通路；(2) 依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)通路。在不依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通路中，DMT1能夠作為一個協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體將金屬離子的向內(nèi)運(yùn)輸和質(zhì)子的向外運(yùn)輸結(jié)合起來。對爪蟾卵母細(xì)胞的電生理研究顯示,在中性膜電位和pH環(huán)境下，DMT1以1∶1的速率轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子和金屬離子。降低膜電位或pH值都可以提高DMT1對金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。這種緊密的關(guān)系可以保護(hù)細(xì)胞免受含過量金屬或酸性環(huán)境的危害[11]。DMT1和TfR的共區(qū)域化預(yù)示著由DMT1攝取錳的通路中肯定有一條是受TfR調(diào)節(jié)的。當(dāng)金屬離子如鐵或者錳結(jié)合到轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物上，由于內(nèi)吞作用金屬離子由細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，然后Ⅴ型ATP酶活化導(dǎo)致吞噬泡變酸進(jìn)而金屬離子從復(fù)合物中解離,這會反過來活化吞噬泡膜上的DMT1協(xié)同運(yùn)輸金屬離子和質(zhì)子，正如圖1[12]所示。

圖1通過血腦屏障攝取錳的分子機(jī)制(來自文獻(xiàn)[12])

2 錳

錳是地殼中廣泛分布的一種元素。錳一般以氧化物、碳酸鹽和硅酸鹽的形式存在。錳還是動物生理機(jī)能不可缺少的7種必需金屬元素之一。作為一種人體的必需微量元素，錳是轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、精氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、超氧化物歧化酶等多種酶的活性基團(tuán)或輔助因子[13]。錳通過對這些酶的調(diào)控參與體內(nèi)多種生理代謝過程，如免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)和碳水化合物的新陳代謝等。錳在神經(jīng)元生長發(fā)育及骨骼形成中亦發(fā)揮重要作用[14]。錳缺乏時(shí)，機(jī)體會出現(xiàn)糖類、脂類的代謝異常，骨骼畸形，生長停滯，生殖功能異常，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等[15]。

盡管錳對于新陳代謝的功能是必需的，但是過多地暴露在富含錳的環(huán)境中是很危險(xiǎn)的，吸入含錳顆粒物和肺部炎癥有關(guān)，在人和靈長類中主要表現(xiàn)是咳嗽、支氣管炎、肺炎和肺功能受損[16]，在嚙齒類動物中表現(xiàn)為鼻上皮組織炎癥[17]。暴露在高錳環(huán)境中的男性員工被報(bào)道出可能會陽痿和失去性欲[18]，可能是由于精氨酸酶在這些功能中起著重要的作用。雖然大多數(shù)的錳是從食物中獲得的，但由飲食造成的錳中毒是很罕見的[19]，這是由于機(jī)體中有腸上皮細(xì)胞的吸收和膽管細(xì)胞的排泄兩條途徑很好地調(diào)節(jié)錳的平衡。相比較而言，嗅球?qū)ξ⒘ｅi的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)可以導(dǎo)致錳在紋狀體和小腦中沉積及鼻上皮組織的炎癥[17]。職業(yè)暴露在錳環(huán)境中6個月到2年會引起錐體束外的綜合征，被稱為錳中毒，不管在分子水平還是臨床水平和先天性帕金森病都極其相似[20]。錳中毒是一種伴隨著步態(tài)紊亂的帕金森綜合征。遭受錳中毒的患者表現(xiàn)出兩相的身體機(jī)能下降的特征，初始相是精神上的憂慮包括情緒的異變、情感的缺乏，隨之而來的第二相是動力缺乏，比如運(yùn)動能力下降、肌張力障礙和運(yùn)動遲緩[21]。錳暴露是一個顯著的公共健康問題，錳作催化劑被廣泛用于數(shù)不盡的工業(yè)生產(chǎn)方法中以及作為汽油的添加劑，作為像代森錳一樣的除菌劑，用來凈化飲用水的高錳酸鹽里也含有錳。這些使得錳中毒在非職業(yè)錳暴露下也時(shí)有發(fā)生。

近年來，隨著納米材料的廣泛使用，尤其是含錳納米材料由于具有其獨(dú)特的電化學(xué)性能如減小極化，增大充放電電流密度，具有優(yōu)良的離子傳導(dǎo)性和較高的電位等得到了非常廣闊的應(yīng)用前景。錳暴露的環(huán)境問題越來越嚴(yán)重，研究[22-23]表明一些人造納米顆粒很容易引起靶器官炎癥，導(dǎo)致大腦損傷；使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)；容易進(jìn)入細(xì)胞甚至細(xì)胞核內(nèi)；有隨尺寸減小而生物毒性增大的趨勢。納米錳顆粒作為一種外源性化合物進(jìn)入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)之后，必然會引起腦組織內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞的功能改變[24]。Oszlanczi等[25]將大鼠暴露在含一定量納米錳的環(huán)境下，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)大鼠均表現(xiàn)出神經(jīng)毒性反應(yīng),如靜止活動增多，步態(tài)紊亂，神經(jīng)末梢傳導(dǎo)速度顯著地降低等。Oszlanczi等[26]還將大鼠暴露在等量的不同狀態(tài)的無機(jī)錳(MnO2和MnCl2)環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)MnCl2的神經(jīng)毒性大于MnO2，可能是因?yàn)樵贛nCl2中錳處于離子狀態(tài)更容易被吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。毛彩霞等[27]研究納米錳和常規(guī)錳對HeLa細(xì)胞的毒性效果發(fā)現(xiàn)，納米MnO2對HeLa細(xì)胞DNA的損傷顯著高于常規(guī)MnO2，提示MnO2顆粒的大小與其毒性效應(yīng)直接相關(guān):在一定范圍內(nèi)，顆粒尺寸越小，DNA損傷效應(yīng)越大。

目前，錳過量引起神經(jīng)毒性的機(jī)制已經(jīng)有一些研究結(jié)果，如造成氧化應(yīng)激、引起線粒體功能異常、凋亡信號Caspase的活化等，但錳轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦的機(jī)制仍然不清楚。在過去的二十年里，人們發(fā)現(xiàn)了各種各樣的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，比如主動運(yùn)輸和易化擴(kuò)散。近年來發(fā)現(xiàn)錳可以通過高親和力的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(如鈣和鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)體)進(jìn)行運(yùn)輸。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體中包括：二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體DMT1，屬于天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白NRAMP家族[28]；ZIP-8，可溶性載體39家族的一員[29]；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)，主要負(fù)責(zé)對三價(jià)的鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[30]；電壓調(diào)節(jié)和鈣庫操縱性鈣離子通道[31]；離子交換的谷氨酸鹽受體鈣離子通道[32]。其中DMT1對錳的轉(zhuǎn)運(yùn)起著至關(guān)重要的作用，也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

3 DMT1在錳轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用

1997年Chua等[33]發(fā)現(xiàn),b/b型大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞以及一些器官(如腎臟、大腦和股骨)對錳的攝取和十二指腸對錳的吸收,相對于野生型大鼠(+/+)和雜合子大鼠(+/b)中顯著減少，提示b/b型大鼠錳代謝的破壞是由于DMT1的突變導(dǎo)致錳攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的不足。Knopfel等[34]在對小腸膜囊泡進(jìn)行的研究也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。最直接驗(yàn)證DMT1是否對錳的轉(zhuǎn)運(yùn)起作用的方法是,當(dāng)環(huán)境中錳含量很高時(shí)檢測DMT1表達(dá)量的變化。Garcia等[35]對幼大鼠進(jìn)行高錳食譜的喂養(yǎng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,大鼠腦中DMT1表達(dá)量上升了35%。這種含量的升高不是區(qū)域特異性的，盡管如此，這個實(shí)驗(yàn)仍然是食物中錳含量的升高伴隨著DMT1表達(dá)量升高的一個很好的直接證據(jù)。此外，這種關(guān)聯(lián)在體外實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。Wang等[36]在對永生的脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞Z310細(xì)胞系錳暴露24 h和48 h后，DMT1的表達(dá)量分別上升了45%和78%，并且他們的研究還發(fā)現(xiàn)：(1) 暴露在高錳的環(huán)境下DMT1的表達(dá)量升高；(2) DMT1 mRNA的含量也升高；(3) 鐵調(diào)節(jié)蛋白和DMT1 mRNA的蛋白-RNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合使mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，增加DMT1的表達(dá)量；(4) DMT1的核不均一RNA的含量并不升高。研究結(jié)果顯示，DMT1通過鐵調(diào)節(jié)蛋白和其mRNA的結(jié)合使mRNA更加穩(wěn)定而不是增加其基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而達(dá)到DMT1蛋白的表達(dá)量的上調(diào)。高錳環(huán)境下，可以誘導(dǎo)炎癥等的發(fā)生，而炎癥因子可以刺激DMT1表達(dá)量的升高[37]，也可能是細(xì)胞中錳含量升高的一個因素。Bai等[38]用不同來源的錳來研究DMT1的作用發(fā)現(xiàn),DMT1對有機(jī)錳(和氨基酸結(jié)合的錳)的轉(zhuǎn)運(yùn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對MnSO4的轉(zhuǎn)運(yùn)，說明不同來源的錳的毒性應(yīng)該也不同，并且證實(shí)了錳存在的條件下DMT1 mRNA的表達(dá)量會增加。He等[39]對中國漢族192名PD患者和193名健康對照用限制性片段長度多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-RFLP)檢測一個突變體(1303C/A)和兩個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)(1254T/C和IVS4+44C/A),對10%的樣本進(jìn)行直接的基因組測序來獲得其基因組分型,結(jié)果在等位基因或突變基因或PD患者中基因型沒有發(fā)現(xiàn)顯著地差異，然而，一個單體型(1254T和IVS4+44C/A都變成C)在PD患者中較對照組中出現(xiàn)的頻率增多(18.2%對11.4%，OR值1.72，95%可信區(qū)間1.15～2.59，P=0.01)。這些結(jié)果提示，在這些人群中DMT1基因型CC可能是PD的一個危險(xiǎn)因子。最近對嗅球中DMT1的研究[40]顯示，在b/b型大鼠中鼻對錳的吸收顯著減少，在鐵缺乏大鼠的嗅球中DMT1的含量升高，可能鐵在DMT1對錳的吸收過程中也起著重要的作用。

綜上所述，細(xì)胞通過膜表面的DMT1攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)外環(huán)境的錳，DMT1會隨著錳含量的升高而表達(dá)量上調(diào)，錳進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)損傷細(xì)胞，從而導(dǎo)致一系列的疾病(如PD等)。此外，DMT1隨著年齡的升高而表達(dá)量升高[41]，這是老年人群更容易患PD的一個可能的原因。

4 展 望

由于DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)錳的機(jī)制并沒有完全明了，DMT1攝取錳的精確的途徑和明確的機(jī)制都需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來探究,以下4個方面應(yīng)該得到重視：(1) 鐵似乎在DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)錳中起著某種作用，眾所周知，鐵和錳對人體都非常重要，且過量都會有毒性，深入探討鐵是否對DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)錳有影響，可以更好地理解微量元素在腦內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程；(2) 在不人為地增加錳含量條件下，上調(diào)DMT1的表達(dá)，是否會對日常飲食中錳的攝取增多，如果增多，那毫無疑問DMT1在錳的轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用；(3) 錳累積之后應(yīng)該會有補(bǔ)償?shù)呐懦i的機(jī)制，從而減輕錳的毒性，到目前為止還沒有研究錳的排出途徑的報(bào)道，如果可以人為地加強(qiáng)這些補(bǔ)救途徑也許對職業(yè)錳中毒的患者會有好的療效；(4) 一些新的研究方法如晶體學(xué)，三維立體研究DMT1的功能，可能會對DMT1轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的機(jī)制有更進(jìn)一步的了解。

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