COPD大鼠氣道上皮CC16 mRNA的表達及意義

方蘇榕，谷偉，譚焰，孫麗華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210006)

慢性阻塞性肺病(COPD)是一個復(fù)雜的、多因素的疾病，它的致病因素有吸煙、感染、氧化應(yīng)激等，其中，最關(guān)鍵的是對吸入的顆粒和氣體的炎癥反應(yīng)(最主要的是煙草)[1]。燃燒的煙頭可以產(chǎn)生成千上萬的氧化物質(zhì)，這些氧化物質(zhì)通過誘發(fā)脂類和其它細胞膜成分的過氧化激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞DNA而損傷氣道上皮細胞[2]。

克拉拉細胞(clara細胞)是支氣管上皮細胞的祖細胞[3]，主要分布于終末細支氣管及呼吸性細支氣管黏膜上皮。CC16是clara細胞分泌的最主要的功能蛋白，也是最重要的內(nèi)源性抗炎因子，可保護遠端支氣管免受炎癥損傷[4]。近來研究發(fā)現(xiàn)，血清CC16水平與其在呼吸道中合成和分泌的速度密切相關(guān)，檢測血清CC16水平可反映肺上皮細胞的完整性和通透性[5]。大量研究表明，肺上皮襯液、肺泡灌洗液及血清中CC16的含量可作為反映clara細胞及肺泡毛細血管膜完整性早期改變的敏感性指標[6]。CC16是氣道上皮重要的內(nèi)源性保護因子，它與多種炎癥細胞因子共同參與氣道的炎癥反應(yīng)。

噻托溴銨作為第2代長效的M膽堿受體阻斷劑，目前在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。噻托溴銨對COPD患者小氣道有修復(fù)作用[7]。本實驗通過分別檢測COPD大鼠及噻托溴胺藥物干預(yù)后氣道上皮CC16 mRNA的表達，探討CC16在COPD發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用煙為江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品的一品梅牌過濾嘴香煙(焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)；LPS購自美國Sigma公司；ELISA檢測試劑盒購自Uscn Life Science股份有限公司；兔抗大鼠CCSP多克隆抗體購自美國Millipore公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(HPR-IgG)及CC16免疫組化檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組及COPD模型的建立

SPF級雄性SD大鼠30只(由浙江省實驗動物中心提供)，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為健康對照組、COPD模型組和噻托嗅銨藥物干預(yù)組，每組10只。采用煙熏加內(nèi)毒素法建立大鼠COPD模型：健康對照組大鼠放入密閉箱內(nèi)但不進行煙熏，2次·d-1，0.5 h·次-1，2次間隔時間為8 h，共90 d。第30、60天氣管內(nèi)分別注入200 μl生理鹽水。COPD組大鼠放入密閉箱內(nèi)，以5%煙霧濃度進行煙熏，2次·d-1，0.5 h·次-1，2次間隔時間為8 h，共90 d。第30、60天不給予煙熏，氣管內(nèi)注入LPS 200 μg·(200 μl)-1。噻托溴銨藥物干預(yù)組大鼠在每次煙熏前30 min霧化吸入噻托溴銨(0.12 mmol·L-1，10 min)，然后以5%煙霧濃度進行煙熏，2次·d-1，0.5 h·次-1，2次間隔時間為8 h，共90 d，第30、60天不給予煙熏，氣管內(nèi)注入LPS 200 μg·(200 μl)-1。除在密閉箱內(nèi)時間外，3組大鼠在相同環(huán)境中飼養(yǎng)，所有大鼠均于第91天處死。

1.3 RT-PCR法檢測CC16 mRNA基因的表達

取肺組織60 mg，用美國基因公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，采用美國基因公司生產(chǎn)的一步法試劑盒進行CC16 mRNA逆轉(zhuǎn)錄和擴增。按試劑盒說明逐一加入試劑及1 μl總RNA和CC16、GAPDH引物各1 μl，體積為50 μl。cDNA合成和預(yù)變性：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min進行1次循環(huán)。PCR法擴增：95 ℃變性40 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共32個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取管家基因GAPDH為陽性對照。GAPDH基因引物序列上游：5′-AAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3′，下游：5′-AGATG ATGACCCTTTTGGCCC-3′，擴增長度352 bp。CC16 mRNA基因引物序列上游5′-ACATCTACAGACAGCCC AAGC-3′，下游5′-AGGGTATCCACCAGCCTCTT-3′，擴增長度241 bp。采用Bio Rad Quantity One成像系統(tǒng)進行圖像分析和掃描，以CC16 mRNA與GAPDH灰度比值反映CC16 mRNA表達量。由于clara細胞位于氣道上皮，所以檢測結(jié)果反映氣道上皮CC16 mRNA的改變。

1.4 免疫組化檢測大鼠肺組織中CC16的蛋白表達

大鼠處死后將細毛細玻璃管固定于右主支氣管內(nèi)，向右肺內(nèi)注射10%中性甲醛溶液，固定24 h；常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色做常規(guī)病理組織學(xué)檢查。按照CC16免疫組化檢測試劑盒說明封片后鏡檢，每張切片取5個高倍視野(×200)，用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測定各組陽性細胞積分光密度值(IOD值)。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測各組大鼠血清中CC16、PLA2、IL8、TNFα以及肺組織勻漿中PLA2、IL8、TNFα的含量

第91天，將大鼠以10%水合氯醛[0.3 ml·(100 g)-1]腹腔內(nèi)注射麻醉后，腹主動脈取血5 ml置于預(yù)冷的采血管中，靜置30 min后，于離心機中以2 000 r·min-14 ℃離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中CC16、PLA2、IL8、TNFα以及肺組織勻漿中PLA2、IL8、TNFα的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理HE染色

健康對照組大鼠支氣管管腔、上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，管壁未見增厚，黏膜下層鮮有炎癥細胞浸潤。COPD模型組大鼠支氣管管腔變形嚴重，柱狀上皮細胞明顯脫落，肺泡壁變薄，肺泡腔擴大融合成肺大泡，纖毛倒伏變形，有的脫落缺失，杯狀細胞增生，管壁明顯破壞、增厚，周圍見大量炎癥細胞浸潤，黏膜下腺體增生肥大。藥物干預(yù)組管腔少許變形，上皮細胞有脫落，纖毛稀疏，倒伏，管壁稍有增厚，周圍有一些炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1大鼠肺組織病理改變(HE×200)

采用平均肺泡直徑(LM)及平均肺泡數(shù)(MAN)進一步定量評估肺氣腫嚴重程度。結(jié)果顯示,COPD組與健康對照組相比平均肺泡數(shù)明顯減少，平均肺泡直徑明顯增大，肺氣腫表現(xiàn)明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。噻托嗅銨藥物干預(yù)組與COPD組相比平均肺泡數(shù)增多，平均肺泡直徑減少，肺氣腫程度明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1平均肺泡直徑和平均肺泡數(shù)(106m-2)

與對照組相比,aP<0.01；與COPD模型組相比,bP<0.05

2.2 CC16 mRNA的表達

COPD模型組較健康對照組大鼠CC16 mRNA表達顯著減少，藥物干預(yù)組較COPD模型組大鼠CC16 mRNA表達增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。見表2、圖2。

表2CC16mRNA檢測結(jié)果

組 別nCC16 mRNA表達健康對照組100.310±0.027COPD模型組100.085±0.006a藥物干預(yù)組100.168±0.026b

與對照組相比,aP<0.01；與COPD模型組相比,bP<0.01

2.3 肺組織CC16的蛋白表達

3組大鼠免疫組化檢測結(jié)果見圖3。免疫組化以各組切片中陽性細胞的IOD值表示，具體數(shù)值詳見表3，結(jié)果顯示COPD模型組較健康對照組大鼠的CC16水平顯著減少，藥物干預(yù)組較COPD模型組的CC16水平顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。

圖2CC16mRNART-PCR電泳結(jié)果

2.4 血清中CC16及血清和肺組織中PLA2、IL8、TNFα含量的變化

COPD模型組大鼠的血清CC16含量低于健康對照組，而PLA2、IL8、TNFα含量均高于健康對照組。藥物干預(yù)組大鼠的血清CC16水平高于COPD模型組，而PLA2、IL8、TNFα水平均低于COPD模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

圖3大鼠肺組織中CC16陽性表達結(jié)果(免疫組化，×200)

組 別n血清ρ(CC16)/(ng·ml-1)ρ(PLA2)/(pg·ml-1)ρ(IL8)/(pg·ml-1)ρ(TNFα)/(pg·ml-1)肺組織CC16含量(免疫組化×105)ρ(PLA2)/(pg·ml-1)ρ(IL8)/(pg·ml-1)ρ(TNFα)/(pg·ml-1)健康對照組100.26±0.05119.09±3.06235.23±4.7146.97±2.840.602±0.122209.39±3.32386.74±5.30145.05±8.77COPD模型組100.23±0.06a159.76±4.77a428.98±9.32a114.28±6.66a0.434±0.073a317.47±10.24a457.10±24.98a222.58±5.63a藥物干預(yù)組100.25±0.02ab138.21±3.94ab273.24±3.05ab67.20±2.46ab0.580±0.087b248.12±6.74ab402.07±13.27b150.95±6.89bF值43.4026.10267.0361.154.6755.764.9635.80P值<0.01<0.01<0.01<0.010.02<0.010.02<0.01

與對照組相比,aP<0.01；與COPD模型組相比,bP<0.01

3 討 論

COPD的病理基礎(chǔ)是慢性氣道炎癥[8]，它以氣道中的中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤為主，伴隨全身的慢性炎癥反應(yīng)[9]。長期吸煙是COPD形成的最主要的病因之一。吸煙可以導(dǎo)致氣道上皮成百上千種基因表達的變化，很多實驗均證實吸煙嚴重影響氣道上皮的轉(zhuǎn)錄物[10]。小氣道(直徑≤2 mm)上皮是吸煙導(dǎo)致COPD形成過程中最早發(fā)生損傷的部位，其變化包括細胞損傷、修復(fù)、凋亡以及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)[11]。通過活檢得到的數(shù)據(jù)顯示COPD的進展伴隨著小氣道的損傷，而小氣道的損傷與氣道壁炎癥因子的滲出及管腔滲出物的累積密切相關(guān)[12]。

CC16主要是由位于終末細支氣管和呼吸性細支氣管上皮細胞的祖細胞-克拉拉細胞分泌的最主要的功能蛋白，是氣道上皮特異性表達的一種內(nèi)源性抗炎因子,占支氣管灌洗液中總蛋白的5%～10%，具有明顯的抗炎及免疫調(diào)節(jié)活性，在炎癥氣道疾病中有保護作用[13]。CC16的抗炎作用主要表現(xiàn)為：(1) 抑制炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶可溶性磷脂酶A2(sPLA2)的活性。CC16是肺組織天然的sPLA2抑制劑[14]。sPLA2有促成炎癥通路和分解表面活性物質(zhì)的雙重作用，它可以分解磷脂膜而損傷細胞生物膜，導(dǎo)致花生四烯酸(AA)的釋放，AA可促進前列腺素、血栓素6、白三烯等炎癥介質(zhì)的釋放，因此CC16能間接抑制這些炎癥介質(zhì)的釋放。CC16還可以保護肺表面活性物質(zhì)的主要成分磷脂不被PLA2降解，從而阻止肺彈性回縮力的減弱和肺殘氣量的增加。(2) CC16能夠直接作用于一些炎癥因子，例如能夠直接抑制TNFα、IFN-γ和IL-8等炎癥因子的生成和活性[15]，從而抑制中性粒細胞和單核細胞的遷移。(3) 抑制單核細胞生成IFN-γ，從而抑制IFN-γ的抗病毒活性和吞噬作用[16]。

本實驗結(jié)果顯示，COPD組大鼠氣道上皮CC16 mRNA表達及肺組織CC16的蛋白含量均顯著低于對照組，而血清及肺組織中PLA2、IL-8、TNF-α的含量均高于對照組，說明在COPD的形成過程中，小氣道clara細胞受損，CC16分泌減少，對于PLA2、IL-8、TNF-α等炎癥因子的抑制減弱，使得肺組織及血清中的PLA2、IL-8、TNF-α的含量升高，促進炎癥反應(yīng)。這一通路可能在COPD的形成過程中發(fā)揮重要作用。

噻托嗅銨是一種長效的新型的M膽堿能受體阻斷劑，目前已被臨床廣泛應(yīng)用于COPD的治療中。噻托嗅銨具有支氣管擴張、抗氣道重塑和獨特的抗炎作用。Incorvaia等[12]的研究顯示，COPD急性加重的患者經(jīng)噻托嗅銨治療后可改善小氣道功能缺損現(xiàn)象。本實驗結(jié)果顯示，COPD形成過程中早期給予噻托嗅銨干預(yù)，氣道上皮中的CC16 mRNA表達及肺組織CC16的蛋白含量均顯著高于COPD組，CC16所抑制的炎癥因子PLA2、IL-8、TNF-α的含量均顯著低于COPD組，且病理結(jié)果顯示藥物干預(yù)后，大鼠肺氣腫程度較對照組減輕。這一結(jié)果從另一方面表明，在COPD形成過程中，小氣道clara細胞受損，氣道上皮中的CC16 mRNA表達下降。早期噻托嗅銨干預(yù)治療可以減少吸煙對于氣道上皮的損傷，使得氣道上皮的重要內(nèi)源性保護因子CC16含量增加，加強對炎癥因子的抑制，從而增加氣道上皮對肺臟的保護功能。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明，在COPD大鼠形成過程中，氣道上皮CC16 mRNA基因表達及肺組織CC16蛋白含量減少，這一改變可能是其小氣道損傷的組織學(xué)標志，且與COPD的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。

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