六味地黃丸聯(lián)合銀杏葉片對(duì)2型糖尿病患者趨化因子fractalkine的影響

王艷萍，余江毅，殷漢，安曉飛，王曉來(lái)，王堯，孫子林

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210009； 2.江蘇省中醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029)

糖尿病慢性并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的主要原因，嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，并增加患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且目前尚無(wú)有效的治療方法。既往研究顯示，六味地黃丸及銀杏葉片等中藥對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥有良好的防治效果，且在臨床上被廣泛使用，但缺少隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)研究，而且其藥理作用機(jī)制不明。因此,本研究旨在通過RCT觀察六味地黃丸和銀杏葉片對(duì)防治2型糖尿病(T2DM)慢性并發(fā)癥的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008年6月至9月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科門診T2DM患者116例，完成研究93例。本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者書面知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1) 符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2) 年齡30～70歲，性別不限；(3) 無(wú)明顯的糖尿病并發(fā)癥，或僅有輕度微血管并發(fā)癥(尿白蛋白排泄量<300 mg·d-1);(4) 血壓≤160/110 mmHg;(5) 體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≤25 kg·m-2;(6) 知情同意，志愿受試。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1) 不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn);(2) 1型糖尿病(T1DM)和特殊類型糖尿病、妊娠糖尿病;(3) 糖尿病重危急癥，如酮癥酸中毒、糖尿病高滲狀態(tài)；(4) 已有大血管并發(fā)癥，如發(fā)生過心肌梗死、腦血管意外、下肢血管病變；(5) 具有嚴(yán)重的心、肝、肺、腎、血液或影響其生存的嚴(yán)重疾病，如腫瘤或艾滋??；(6) 妊娠期、哺乳期婦女；(7) 根據(jù)研究者的判斷具有降低入組可能性或使入組復(fù)雜化的其他情況，如工作環(huán)境經(jīng)常變動(dòng)等易造成失訪的情況；(8) 正在服用可能影響血脂等觀察指標(biāo)的其他藥物；(9) 正在參加其他藥物臨床研究。

1.4 分組

(1) 病例數(shù)：按1∶1對(duì)照原則，中藥組與對(duì)照組各58例，共116例。最后完成實(shí)驗(yàn)納入統(tǒng)計(jì)分析中藥組49例，對(duì)照組44例。(2) 隨機(jī)分組方法：采用區(qū)組隨機(jī)化方法。(3) 盲法設(shè)計(jì)：采用雙盲設(shè)計(jì)，中藥組為基礎(chǔ)治療加六味地黃丸和銀杏葉片，對(duì)照組為基礎(chǔ)治療加安慰劑。二級(jí)設(shè)盲，第一級(jí)為各病例號(hào)所對(duì)應(yīng)的組別(如A和B組)，第二級(jí)為兩組所對(duì)應(yīng)的處理(中藥組和對(duì)照組)。(4) 治療方案：兩組均給予降糖、降壓等基礎(chǔ)治療。中藥組加用仲景牌六味地黃丸(河南省宛西制藥股份有限公司)，口服，8粒·次-1，3次·d-1；銀杏葉片(江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán))，口服，2片·次-1，3次·d-1。對(duì)照組加服相應(yīng)的安慰劑。連續(xù)服藥24個(gè)月，患者每1個(gè)月復(fù)診1次。血糖、血壓控制目標(biāo)水平：空腹血糖(FBG)≤7.0 mmol·L-1，餐后2 h血糖(PBG)≤10.0 mmol·L-1，血壓≤140/90 mmHg。為避免血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、調(diào)脂藥、阿司匹林類藥物對(duì)微量白蛋白排泄率及血脂等的影響，試驗(yàn)前3個(gè)月及試驗(yàn)期間禁服此類藥物。

1.5 觀察指標(biāo)

包括兩組干預(yù)前及干預(yù)24個(gè)月后體質(zhì)量指數(shù)(BMI=體質(zhì)量/身高2)、腰圍(Wc)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、FBG、PBG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmAlb)、尿肌酐(UCr)。血清學(xué)及尿液指標(biāo)由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院檢驗(yàn)科統(tǒng)一檢測(cè),頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜厚度(IMT)由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院B超室統(tǒng)一檢測(cè);踝肱比(ABI)由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科足病專業(yè)護(hù)士統(tǒng)一檢測(cè)。計(jì)算尿微量白蛋白/肌酐比值(ACR=UmAlb×8 840/UCr)和腎小球清除率[男：GFR=(140-年齡)×體質(zhì)量/(0.818×Scr)；女：0.85×(140-年齡)×體質(zhì)量/(0.818×Scr)][1]。ELISA法檢測(cè)干預(yù)24個(gè)月后血清fractalkine(Lot 301156，R&D，USA)、CRP(Lot 78034031，Bender MedSystems GmbH，Austria)、MMP2(Lot 303216，R&D，USA)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者干預(yù)前后臨床資料比較

基線年齡、性別、病程、糖尿病家族史、冠心病家族史、吸煙史等兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩組資料均衡可比(表1)。干預(yù)前后，BMI、WC、SBP、DBP、FBG、PBG、TG、HDL、HbA1c、ACR在兩組患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TC、LDL在兩組患者間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這種差異可能是入組時(shí)兩組間患者的原始差異而導(dǎo)致，并不是藥物作用效果。但是GFR在基線時(shí)中藥組明顯低于對(duì)照組，而中藥干預(yù)24個(gè)月后，對(duì)照組GFR下降，中藥組GFR上升，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥組IMT呈下降趨勢(shì)，ABI沒有明顯變化。

表1兩組患者臨床資料比較

Tab1Metabolicparametersatthebaselineand24monthstreatmentofcontrol(n=44)andTCM(n=49)

指 標(biāo)基線對(duì)照組(n=44)中藥組(n=44)24個(gè)月后對(duì)照組(n=44)中藥組(n=44)年齡/歲59.00(56.00,66.00)63.00(58.50,65.50)(男/女)/例26/1820/29病程/月54.50(24.25,100.75)72.00(24.50,107.50)糖尿病家族史(有/無(wú))/例23/2125/24冠心病家族史(有/無(wú))/例23/2240/9吸煙史(有/無(wú))/例30/1440/9BMI/(kg·m-2)23.84±3.0023.34±2.6723.85±2.6823.80±3.17腰圍/cm84.06±8.2683.24±7.9684.80±8.4983.44±8.38SBP/mmHg124.13±11.36123.12±14.82120.07±11.05123.12±14.82DBP/mmHg76.06±6.7175.14±7.8874.37±7.2272.80±7.39bc(FBG)/(mmol·L-1)6.86(6.18,8.08)7.09(6.41,7.90)6.40(5.70,7.40)a6.50(5.70,7.30)bc(PBG)/(mmol·L-1)10.26(8.08,12.81)9.85(8.15,13.14)9.75(7.80,11.62)8.70(7.28,11.00)bc(TC)/(mmol·L-1)4.52±0.914.94±1.06a4.43±0.835.01±0.86cc(TG(/(mmol·L-1)0.96(0.68,1.44)1.09(0.78,1.59)1.15(0.76,1.83)a1.08(0.79,1.92)c(HDL)/(mmol·L-1)1.28±0.301.33±0.321.19±0.31a1.33±0.40c(LDL)/(mmol·L-1)2.65±0.693.10±0.72a2.67±0.673.11±0.82cHbA1c/%7.20±1.817.23±1.156.54±1.16a6.74±0.93bρ(ACR)/(mg·g-1)11.38(6.55,17.59)14.28(8.52,28.47)8.58(6.68,15.35)12.70(7.54,20.71)c(Scr)/(mmol·L-1)74.22±20.7673.47±14.6979.07±12.0573.47±14.69GFR/(ml·min-1·1.73m-2)82.30(72.91,97.94)72.95(59.85,81.67)a77.85(62.01,91.72)a73.76(57.25,91.54)IMT/mm1.12±0.141.12±0.161.13±0.111.09±0.19ABI0.79±0.180.80±0.200.83±0.220.83±0.20

與基線對(duì)照組比較，aP<0.05;與基線中藥組比較,bP<0.05;與24個(gè)月后對(duì)照組比較,cP<0.05

2.2 相關(guān)性分析

ACR與干預(yù)與否(r=-0.21，P=0.05)、GFR(r=-0.23，P=0.00)、TC(r=0.37，P=0.00)、LDL(r=0.28，P=0.01)、fractalkine(r=0.34，P=0.00)、CRP(r=0.43，P=0.00)有明顯相關(guān)性；IMT與年齡(r=0.30，P=0.00)、病程(r=0.29，P=0.00)、CRP(r=0.20，P=0.04)呈正相關(guān)；ABI與相關(guān)變量未見相關(guān)性。

2.3 回歸分析

分別將ACR、IMT、ABI取對(duì)數(shù)后為應(yīng)變量(滿足正態(tài)分布要求)，以ACR、IMT、ABI相關(guān)危險(xiǎn)因素及保護(hù)性因素為自變量進(jìn)行回歸分析，最后進(jìn)入ACR模型有意義的變量為分組情況(r=-2.04，P=0.05)、fractalkine(r=2.25，P=0.03)、CRP(r=2.22，P=0.03)，進(jìn)入IMT模型有意義的變量為CRP(r=2.13，P=0.04)；ABI未見明顯陽(yáng)性結(jié)果。提示服用研究用藥為糖尿病慢性并發(fā)癥的保護(hù)性因素，fractalkine、CRP為其危險(xiǎn)因素。

2.4 兩組間炎癥因子的比較

經(jīng)中藥聯(lián)合治療24個(gè)月后，對(duì)照組血清fractalkine由0.49(0.33，0.78)ng·ml-1上升至0.69(0.51，0.92)ng·ml-1(P>0.05)，中藥組由0.66(0.32，0.79)ng·ml-1下降至0.55(0.35，0.69)ng·ml-1(P<0.05)(表2)。中藥組CRP低于對(duì)照組[(0.73±0.59)vs(0.96±0.79)mg·L-1，P=0.19]，MMP2高于對(duì)照組[(186.66±72.68)vs(173.43±59.91)ng·ml-1，P=0.34]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2兩組患者干預(yù)前后fractalkine的變化

Tab2Theeffectof24monthstreatmentinthecontrol(n=44)andTCMgroup(n=49)onfractalkine

組 別ρ(fractalkine)/(ng·ml-1)對(duì)照組(n=44)基線0.49(0.33,0.78)0.67±0.5924個(gè)月后0.69(0.51,0.92)0.78±0.43差值0.11±3.49治療組(n=49)基線0.66(0.32,0.79)0.62±0.1624個(gè)月后0.55(0.35,0.69)a0.56±0.25差值-0.06±2.83a

與對(duì)照組比較,aP<0.05

3 討 論

糖尿病慢性并發(fā)癥病理機(jī)制復(fù)雜，臨床上尚缺乏特異有效藥物。與西藥的單一作用靶點(diǎn)不同，中醫(yī)中藥可根據(jù)T2DM患者的臨床表現(xiàn)辨證施治，在患者體內(nèi)多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)發(fā)揮療效。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[2-4]發(fā)現(xiàn),六味地黃丸與銀杏葉片能夠有效減少糖尿病腎病患者尿微量白蛋白水平，可以延緩T2DM患者頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜的增厚，減少大血管并發(fā)癥的發(fā)生。

六味地黃丸由熟地黃、山茱萸、干山藥、澤瀉、茯苓、丹皮六味藥組成，以補(bǔ)腎陰為主，其藥理研究已較全面深入，有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗腫瘤等作用，在中國(guó)、日本和其他亞太地區(qū)被作為糖尿病和腎臟疾病的保護(hù)性用藥而廣泛用于臨床[5-6]。銀杏葉片主要成分為銀杏黃酮甙、銀杏內(nèi)甙和白果內(nèi)甙等，具有抑制血小板聚集、降低血液黏度、清除氧自由基等作用，可以抑制胞外基質(zhì)沉積及腎組織中核因子-κB(NF-κB)的活化，減少超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等的表達(dá)而控制過強(qiáng)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[7-8]。據(jù)此我們推測(cè),它們可能通過影響炎癥通路發(fā)揮其糖尿病慢性并發(fā)癥防治效應(yīng)。

近年來(lái)，炎癥反應(yīng)在糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生機(jī)制中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注。越來(lái)越多的動(dòng)物及臨床試驗(yàn)證明,免疫炎癥反應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子、急性期反應(yīng)蛋白及凝血因子等炎癥反應(yīng)因子在糖尿病慢性并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。CRP是經(jīng)典的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，在T2DM患者中明顯升高[9]，是糖尿病血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素[10]。細(xì)胞因子尤其是趨化因子吸引單核巨噬細(xì)胞等進(jìn)入腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)是始動(dòng)糖尿病腎病的早期事件[11]。本課題組既往體外研究[12-13]提示,趨化因子fractalkine可通過與MMP2的交互作用增加促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞在腎小球系膜區(qū)浸潤(rùn)與聚集，增加胞外基質(zhì)的沉積，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

我們研究發(fā)現(xiàn)，fractalkine與ACR呈正相關(guān)，是糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素，經(jīng)中藥聯(lián)合治療24個(gè)月后，相較于對(duì)照組的上升趨勢(shì)，治療組血清fractalkine顯著下降，但是MMP2在兩組間沒有差異。提示六味地黃丸聯(lián)合銀杏葉片治療可以通過降低趨化因子fractalkine的血清含量，從而減少單核巨噬細(xì)胞在腎小球系膜區(qū)浸潤(rùn)與聚集進(jìn)而減少胞外基質(zhì)的沉積，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。CRP與ACR、IMT呈正相關(guān)，是尿微量白蛋白、IMT增厚的危險(xiǎn)因素。提示CRP與fractalkine參與了糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果[9,14-15]一致。

本研究尚存不足：(1) 樣本量不足。本研究受國(guó)家十一五支撐計(jì)劃支持，來(lái)源于一個(gè)多中心隨機(jī)雙盲對(duì)照研究，研究對(duì)象僅取自一個(gè)中心(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)，故樣本量有限。(2) 脫落病例數(shù)較高。由于研究用藥為中藥，有苦澀味，有中藥氣味，安慰劑只能做到形似，但是不能做到氣味口味一致。部分患者能自行辨認(rèn)所服用藥物為安慰劑而要求退出實(shí)驗(yàn)。(3) 缺乏部分基線數(shù)據(jù)。檢測(cè)的CRP、MMP2等炎癥相關(guān)指標(biāo)僅限于干預(yù)24個(gè)月后的血標(biāo)本，僅有24個(gè)月后的橫斷面研究數(shù)據(jù)。因此對(duì)于炎癥指標(biāo)討缺乏干預(yù)前后的對(duì)比情況。

4 結(jié) 論

本研究揭示了CRP、fractalkine等炎癥相關(guān)因子為糖尿病慢性并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素，顯示六味地黃丸聯(lián)合銀杏葉片可以有效減少fractalkine的釋放，抑制胞外基質(zhì)沉積，從而為糖尿病慢性并發(fā)癥的防治研究以及認(rèn)識(shí)中藥藥理作用機(jī)制提供一個(gè)新思路。

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