四君子湯和理中湯對(duì)脾虛腸易激綜合征大鼠一氧化氮信號(hào)通路及胃動(dòng)素表達(dá)影響的差異

段永強(qiáng) 程衛(wèi)東 李蘭珍 成映霞 程 容 楊曉軼 張 晶 杜 娟

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅 蘭州 730020)

腸易激綜合征(IBS)是由于腸道動(dòng)力學(xué)和內(nèi)臟感覺異常所導(dǎo)致的胃腸道功能性疾病，以持續(xù)存在或間歇發(fā)作的排便習(xí)慣改變、糞便性狀異常(稀便、黏液便)、腹脹及腹痛等為表現(xiàn)的臨床綜合征。流行病學(xué)研究表明我國(guó)IBS患病人群以腹瀉型為多發(fā)，由于IBS缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學(xué)改變和生化異?！?〕，故目前認(rèn)為腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)與精神因素，胃腸激素分泌紊亂，炎癥介質(zhì)及免疫因子促發(fā)等因素有關(guān)〔2〕，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)此病尚無(wú)完全有效治療藥物。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為D-IBS與中醫(yī)脾虛證或脾虛為主證的臟腑病證密切相關(guān)〔3，4〕，臨床多應(yīng)用以益氣健脾止瀉或溫中健脾止瀉類中藥復(fù)方為主進(jìn)行干預(yù)，療效顯著。本研究探討四君子湯和理中湯對(duì)D-IBS大鼠血清及小腸組織一氧化氮信號(hào)通路(NO/NOS)及胃動(dòng)素(MOT)表達(dá)差異的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物 采用SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，3月齡，體重(180±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK〔甘〕2011-0001-0001011；實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證SYXK〔甘〕2011-0001-0000315)。

1.2藥物與試劑

1.2.1四君子湯 以人參、白術(shù)、茯苓、甘草原藥材按3∶3∶3∶2比例配制并加工，第1次加10倍量蒸餾水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液置70℃～80℃水浴濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后4℃冰箱備用，用時(shí)配至所需濃度。

1.2.2理中湯 以人參、白術(shù)、干姜、甘草原藥材按1∶1∶1∶1比例配制并加工，第1次加10倍量蒸餾水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液置70℃～80 ℃水浴濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后置4℃冰箱備用，用時(shí)配至所需濃度。

1.2.3番瀉葉制劑 將番瀉葉粉碎成粉，用蒸餾水浸泡，置于50℃水浴6 h濃縮為含量1 g/ml藥劑，去渣取汁4℃保存,使用時(shí)稀釋至所需濃度。以上中藥原藥材均購(gòu)自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司，并經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系中藥生藥學(xué)教研室楊扶德教授鑒定合格。

1.3試劑盒 考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，批號(hào)20110925；一氧化氮(NO)試劑盒，批號(hào)20110923；一氧化氮合酶(NOS)試劑盒，批號(hào)20110926(南京建成醫(yī)學(xué)生物研究所)；胃動(dòng)素(motilin，MOT)放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20111010)。

1.4主要儀器 DF110型電子分析天平(常熟衡器工業(yè)公司，江蘇省常熟市)；721型可見光分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器制造公司，北京)；XYJ80-2離心機(jī)(江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司，江蘇省金壇市)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱(常州國(guó)華電器有限公司，江蘇省常州市)；FT-630G微機(jī)多探頭r計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)；KDC-2044低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1分組與造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后，受試動(dòng)物按體重編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法〔5〕分為空白組(n=10)和造模組(n=60)。除空白組外，造模組大鼠參照文獻(xiàn)〔6〕造模：以番瀉葉煎劑溶液(0.4 g/ml)按10 ml/kg劑量灌胃，1次/d；在灌服完番瀉葉煎劑1 h后,即用粗制棉繩束縛大鼠的兩后肢，使之行動(dòng)不便，躁動(dòng)不安，造成一定應(yīng)激刺激，持續(xù)2 h，1次/d，以上兩法復(fù)合連續(xù)造模時(shí)間持續(xù)14 d。造模結(jié)束后篩選符合D-IBS模型大鼠，并采用隨機(jī)法分為D-IBS模型組、四君子湯組、理中湯組，每組10只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。

1.5.2給藥方法 造模14 d結(jié)束后，四君子湯組給予20 g·kg-1·d-1四君子湯藥劑灌胃，理中湯組給予20 g·kg-1·d-1理中湯藥劑灌胃，等效劑量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究“等效劑量”計(jì)算方法(按60 kg成人體表面積換算標(biāo)準(zhǔn)劑量2倍量)折算，灌胃容積為10 ml/kg體重，連續(xù)灌胃給藥14 d，空白組、IBS模型組給予同體積蒸餾水灌胃；各組均以蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.5.3胃排空實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)〔7〕：從第14天晚上8時(shí)開始禁食、不禁水至第16天早晨8時(shí)，共禁食36 h。給半固體營(yíng)養(yǎng)糊2 ml，30 min后用10%水合氯醛麻醉后股動(dòng)脈采血，制備待檢標(biāo)本。隨后迅速打開腹腔，結(jié)扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第1次稱重(胃總重)，后剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分第2次稱重(胃凈重)，按公式計(jì)算：胃殘留率=(胃總重-胃凈重)/2×100%。

1.5.4小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)〔8〕：結(jié)扎幽門和回盲部，分離腸系膜，測(cè)量幽門至回盲部的長(zhǎng)度作為小腸總長(zhǎng)度，從幽門至營(yíng)養(yǎng)糊黑染的距離作為小腸推進(jìn)長(zhǎng)度。按公式計(jì)算：小腸推進(jìn)率=營(yíng)養(yǎng)糊推進(jìn)距離(cm)/小腸全長(zhǎng)(cm)×100%。

1.5.5標(biāo)本采集與效應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)

1.5.5.1血清胃動(dòng)素(MOT)測(cè)定 將股動(dòng)脈取得的3 ml，靜置2 h后離心(2 000 r/min)10 min，取上清，放入尖底管中4℃低溫冰箱保存待測(cè)效應(yīng)指標(biāo)。

1.5.5.2小腸組織的收集 大鼠處死后，迅速將近胃竇端小腸組織截取，稱重后分別用眼科小剪刀快速剪碎，分別置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，并以3 500 r/min 離心10 min，取上清液置4℃冰箱保存，采用化學(xué)比色法檢測(cè)NO/NOS，放免法檢測(cè)MOT。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般生存情況 空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏，活動(dòng)及飲食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。D-IBS模型組大鼠多數(shù)在第4天即開始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯；第7天后出現(xiàn)怠動(dòng)少食、消瘦拱背，肛周污穢，部分動(dòng)物出現(xiàn)脫肛，甚至動(dòng)作遲緩，同時(shí)毛發(fā)失去光澤而枯槁、疏散，成群蜷縮或拱背，并逐漸出現(xiàn)體重減輕，大便增多(墊料呈橘黃色)等“脾虛”癥狀(D-IBS模型組1只大鼠因灌胃操作不當(dāng)致死，尸檢未見明顯異常)。四君子湯、理中湯組大鼠第6天出現(xiàn)輕度倦臥、被毛稀疏干枯；第9天后出現(xiàn)少食、怠動(dòng)、消瘦，肛周污穢，少部分動(dòng)物出現(xiàn)脫肛，動(dòng)作遲緩，大便增多等，第12天后上述癥狀開始減輕或消失，表現(xiàn)為反應(yīng)較為靈敏，活動(dòng)及飲食量正常，被毛疏散但有光澤，糞便呈顆粒狀。

2.2各組大鼠胃殘留率和小腸推進(jìn)率的比較 與空白組比較，模型組大鼠胃殘留率明顯升高，小腸推進(jìn)率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，四君子湯和理中湯均能降低胃殘留率和小腸推進(jìn)率，但以理中湯作用顯著(P<0.05，P<0.01)，且在抑制小腸推進(jìn)率方面，理中湯組較四君子湯顯著(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠血清及小腸組織NO/NOS表達(dá)差異的比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血清及小腸組織NO、NOS計(jì)數(shù)水平有下降趨勢(shì)(P<0.01，P<0.05)；經(jīng)中藥干預(yù)后并與模型組比較，四君子湯和理中湯均能升高血清及小腸組織NO、NOS水平，(P<0.05)，且在調(diào)節(jié)小腸組織NO、NOS方面，理中湯組與四君子湯比較以理中湯作用顯著(P<0.05)。

表1 各組大鼠胃殘留率和小腸推進(jìn)率的比較±s，%)

表2 各組大鼠血清及小腸組織NO/NOS表達(dá)差異的比較±s)

2.4各組大鼠血清及小腸組織MOT表達(dá)差異的比較 與空白組比較，模型組大鼠血清及小腸組織MOT水平均顯著升高(P<0.01)；經(jīng)中藥干預(yù)后，四君子湯和理中湯均能降低血清及小腸組織MOT水平(P<0.05，P<0.01)，且在調(diào)節(jié)小腸組織MOT水平方面，四君子湯和理中湯組比較，以理中湯作用顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及小腸組織MOT表達(dá)差異的比較±s)

3 討 論

IBS是一種臨床最常見的慢性腸功能紊亂疾病，由于該病缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學(xué)改變和生化異常，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，常以結(jié)腸癥狀為主，也可表現(xiàn)為消化道其他癥狀甚至軀體癥狀。目前IBS的病因尚未完全明了，但涉及因素較多，與腸道運(yùn)動(dòng)異常、內(nèi)臟感覺異常、腦腸相互作用、神經(jīng)免疫機(jī)制紊亂等有關(guān)。其中腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)是胃腸壁內(nèi)的自主神經(jīng)系統(tǒng)，具有獨(dú)立于大腦而行使其功能的完整結(jié)構(gòu)。研究表明〔7，8〕NOS廣泛分布于胃腸道，其產(chǎn)物NO是非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)的抑制性遞質(zhì)，廣泛參與胃腸生理功能。NO不僅在神經(jīng)傳導(dǎo)、胃腸保護(hù)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和宿主防御機(jī)制中起重要作用，而且參與多種病理發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔9〕。生理性的NO對(duì)胃動(dòng)力的影響是一個(gè)抑制性過程，具有延緩胃排空功能，而NO分泌不足或過量均可導(dǎo)致胃腸黏膜受損和運(yùn)動(dòng)紊亂。已有研究〔10〕發(fā)現(xiàn)胃平滑肌細(xì)胞和胃肌間神經(jīng)叢含有大量的NOS，說明了NO在調(diào)節(jié)胃動(dòng)力中的重要性。

如 Sjolund等〔11，12〕學(xué)者研究表明,IBS的胃結(jié)腸反射(進(jìn)食可以刺激結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，引起結(jié)腸收縮增加，從而激發(fā)便意，稱為胃結(jié)腸反射)多由胃腸激素濃度的變化調(diào)節(jié)，而且胃腸激素對(duì)胃腸道的分泌、運(yùn)動(dòng)、吸收、營(yíng)養(yǎng)和免疫等起著重要作用,它們的分泌異?？蓪?dǎo)致胃腸道運(yùn)動(dòng)紊亂。MOT作為胃腸激素之一，是由22個(gè)氨基酸組成的多肽，全部小腸均有分布，其主要作用是促進(jìn)和影響胃腸運(yùn)動(dòng)及胃腸道對(duì)水、電解質(zhì)的運(yùn)輸。MOT可通過激發(fā)消化間期肌電活動(dòng)Ⅲ相、促進(jìn)胃強(qiáng)力收縮和小腸分節(jié)運(yùn)動(dòng)，該運(yùn)動(dòng)呈周期性出現(xiàn)并向小腸遠(yuǎn)端傳播，故MOT有促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用〔13〕。臨床研究表明〔14〕IBS患者血漿MOT水平過高時(shí)，腸道蠕動(dòng)加速，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉等癥狀。

中醫(yī)學(xué)基于D-IBS持續(xù)存在或間歇發(fā)作的“腹瀉、腹痛或食入即瀉”等臨床癥狀群特征，將其歸納為“泄瀉、腹痛”等范疇，認(rèn)為本病病因在于外邪直中、飲食不節(jié)、勞倦體虛等，導(dǎo)致脾胃虛弱，升降失調(diào)，或脾虛濕盛，下注大腸，雖病位在腸，但其本在脾，故證候類型多歸納為脾虛證或脾虛濕盛證，亦有大量研究表明脾虛證都存在腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌異常、胃腸道運(yùn)動(dòng)和小腸分泌吸收功能紊亂〔15〕，由此提示IBS發(fā)生與中醫(yī)脾虛證的病機(jī)實(shí)質(zhì)關(guān)系密切，而且在中醫(yī)臨床上諸多醫(yī)家常常應(yīng)用益氣健脾的四君子湯或溫中健脾的理中湯加減治療脾虛腹瀉之癥。經(jīng)方四君子湯以人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草四味藥物配伍組成共湊益氣健脾之功，而理中湯以人參、白術(shù)、干姜、炙甘草配伍組成共湊溫中健脾之功，兩首復(fù)方雖均能治療脾虛腹瀉之證，但理中湯配方中以干姜替代茯苓，加強(qiáng)了溫中散寒，回陽(yáng)燥濕的功效。

本研究結(jié)果提示D-IBS大鼠存在胃腸排空、轉(zhuǎn)運(yùn)功能紊亂，NO信號(hào)通路關(guān)鍵分子和胃腸激素分泌紊亂；D-IBS大鼠經(jīng)中藥干預(yù)后并與模型組比較，四君子湯和理中湯均能降低胃殘留率和小腸推進(jìn)率，升高血清及小腸組織NO、NOS水平，降低血清及小腸組織MOT水平，說明四君子湯和理中湯調(diào)節(jié)D-IBS大鼠小腸NO、NOS、MOT作用相似，且理中湯在調(diào)節(jié)小腸組織NO、NOS、MOT表達(dá)水平方面的作用優(yōu)于四君子湯，提示理中湯較四君子湯去茯苓加用干姜后，加強(qiáng)了溫中散寒，燥濕止瀉之功，說明恢復(fù)中土脾之陽(yáng)氣是中醫(yī)藥治療脾虛腹瀉型IBS的作用途徑之一，但四君子湯和理中湯干預(yù)IBS的其他作用機(jī)制差別還需要深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

1中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì).腸易激綜合征的共識(shí)意見〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2003；42(9)：669-70.

2楊 紅，錢家鳴.胃腸激素與腸易激綜合征〔J〕.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2002；11(4)：367-9.

3吳 兵，張聲生.腸易激綜合征腹瀉型的證候?qū)W研究進(jìn)展〔J〕.北京中醫(yī)藥，2007；26(5)：312-4.

4譚遠(yuǎn)忠，魏文斌，劉 華.運(yùn)脾化濕中藥對(duì)腸易激綜合征脾胃濕阻證患者AQP8表達(dá)的影響研究〔J〕.中藥材，2009；32(9)：1487-9.

5苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)〔M〕.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1997:142.

6查安生，張樹卿，周 導(dǎo)，等.逍遙煎劑對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠的治療作用〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2008；16(3)：165-7.

7王啟之.一氧化氮與胃腸道疾病關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001；26(2):183-4.

8龍慶林,王振華.一氧化氮對(duì)大鼠胃竇肌間神經(jīng)叢膽堿能神經(jīng)的影響〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1999；21(12):892-3.

9姚 泰.生理學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:204.

10余 躍.一氧化氮對(duì)胃腸分泌機(jī)能的調(diào)節(jié)作用〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè),2000；19(2):123-4.

11Sjolund K,Ekman R,Lindgren S,etal.Disturbed motilin and cholecys-tokinin release in the irritable bowel syndrome〔J〕.Scand J Gastroenterol,1996；31:1110-4.

12鄭小偉，王 穎，宋 紅.三種脾氣虛證模型大鼠血清胃泌素及胃竇G細(xì)胞的比較研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2006；21(6):338-40.

13唐星火,韓 萍,韋宗平.腸易激綜合征者血漿胃動(dòng)素水平分析〔J〕.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1996；1(34)：48-9.

14陳 力.氟西汀聯(lián)合雙歧三聯(lián)活菌膠囊治療性腸易激綜合征的臨床觀察〔J〕.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010；31(6)：41- 2.

15楊江升，徐 珊，申屠利明，等.寧心安神法對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠生長(zhǎng)抑素的影響〔J〕.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011；35(5):710-2.