ET-1基因多態(tài)性與海南黎族人原發(fā)性高血壓的相關(guān)性

王 鎮(zhèn) 張 勇 吳 懇 金水晶 蘇 婭 周代峰 邱逸敏 黃 玲 晏輝芳

(海南省干部療養(yǎng)院，海南 ?？?571100)

原發(fā)性高血壓(EH)是遺傳與環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。內(nèi)皮素-1(ET-1)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管收縮肽，也是迄今所致人體內(nèi)最強烈的血管收縮劑，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程。近些年來研究發(fā)現(xiàn)該基因與EH的發(fā)生密切相關(guān)?；蚨鄳B(tài)性是形成個體差異的遺傳基礎(chǔ)，也是很多疾病發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)。獲得ET-1基因多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)性，對EH的防治具有重要意義。國內(nèi)外有許多學(xué)者對ET-1基因多態(tài)性與高血壓相關(guān)性進(jìn)行研究，但是研究結(jié)果因不同種族不同地區(qū)人群及不同研究方法有差異。本研究擬探討ET-1基因的三個多態(tài)性位點ET-1+138A/-、 K198N、G8002A與海南黎族EH的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1對象 EH組：隨機選取2010～2013年于海南省老年病醫(yī)院住院的海南籍黎族無血緣關(guān)系的EH病人98例，診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)與國際高血壓學(xué)會(ISH)和2004年中國高血壓防治指南標(biāo)準(zhǔn)，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。所有入選者排除繼發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤及嚴(yán)重肝腎功能損害。正常血壓對照組：隨機選取海南籍黎族健康居民244例，無血緣關(guān)系和高血壓家族史，排除冠心病，糖尿病，腫瘤，肝腎功損害者。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成 從GenBank中獲得人類ET-1基因的DNA全序列和mRNA序列, 用PRIMER6.0 軟件輔助設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.2.2基因多態(tài)性檢測 ①PCR 擴增：每個多態(tài)位點均設(shè)立2個PCR檢測管,分別加入寡核苷酸正常和突變引物用于檢測每個多態(tài)位點正常和突變的等位基因。反應(yīng)總體積為20 μl，反應(yīng)體系如下：每管在1×PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.1～0.15 μmol/L，4種dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康為世紀(jì))1 U。加入1滴石蠟油覆蓋。PCR循環(huán)條件為94℃30 s，56℃30 s，72℃50 s，最后在72℃延伸10 min。②序列測定：隨機抽取經(jīng)上述建立的等位基因特異性PCR技術(shù)檢測后分型出的各種ET-1基因型的DNA樣本，用測序引物對擴增包含有各突變位點的特異DNA片段，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA 序列測定。③基因分型：每種ET-1基因突變位點都利用突變型引物和野生型引物同時進(jìn)行兩管PCR擴增，根據(jù)每個樣品兩種等位基因擴增產(chǎn)物結(jié)果，可準(zhǔn)確判定樣品的基因類型。

表1 等位基因特異性PCR的引物序列及擴增片段長度

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 基因頻率采用基因計數(shù)法計算。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度χ2及組間基因型與等位基因頻率比較用χ2檢驗。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1ET-1基因三個多態(tài)位點的基因分型結(jié)果 在海南黎族人群中，K198N位點檢測出了198GG、198GT和198TT三種基因型,G8002A位點檢測出了8002GG、8002GA和8002AA三種基因型,+138A/-位點檢測出了138(4A4A)、138(4A3A)和138(3A3A)三種基因型。K198N位點在高血壓組和正常對照組間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，+138A/-在組間的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，而G8002A在組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2ET-1基因三個多態(tài)位點等位基因型檢測結(jié)果 表3可見，K198N的G和T兩個等位基因在高血壓組和對照組間的分布頻率無顯著差異，G8002A位點的G和A兩個等位基因的分布頻率具有顯著差異(P<0.05), +138A/-位點3A和4A兩個等位基因的分布頻率具有極顯著的組間差異(P<0.01)。

表3 各組中ET-1基因三種多態(tài)位點的等位基因頻率〔n(%)〕

3 討 論

EH主要是由于患者血管張力的變化所致，而后者主要受到血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的各種血管收縮因子和血管舒張因子的拮抗所影響。在上述因子中血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素和NO三類因子的平衡最為重要，一旦該平衡被打破，就可能導(dǎo)致血管張力的改變進(jìn)而導(dǎo)致EH的發(fā)生。ET-1主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，是血管收縮最重要的控制因子，該因子與血壓的升高呈正相關(guān)，因而被認(rèn)為可將其濃度作為判斷EH病情的指標(biāo)〔3～5〕。EH-1的濃度及活性主要取決于基因的形式，而SNP作為最常見的基因突變形式，可能與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)。研究ET-1基因SNP位點多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)，可能為原發(fā)性高血壓的診斷、預(yù)測及干預(yù)提供參考依據(jù)。ET-1的編碼基因EDN1位于6p23-p24，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因存在多態(tài)多態(tài)位點，例如轉(zhuǎn)錄起始部位1370TG，外顯子1的+138A-，內(nèi)含子1的+1932G/A，第198個密碼子K198N，第4外顯子的8000T/G等。本研究選取+138A/-、 K198N、G8002A 3個多態(tài)性位點作為研究對象。EH組中+138A/-位點4A3A基因型分別頻率明顯高于正常對照組，提示基因型4A3A可能是血壓升高的一個危險因素。等位基因3A、4A在EH組分布頻率顯著高于正常對照組，說明海南籍黎族EH患者中4A型等位基因可能是血壓升高的危險因素。

K198N(Lys198Asn)是ET-1基因第158號密碼子中的G突變?yōu)門而導(dǎo)致了賴氨酸與天冬氨酸的轉(zhuǎn)換，是目前文獻(xiàn)中報道較多的多態(tài)位點〔6～8〕。海南籍黎族EH組K198N位點的GT基因型分布頻率明顯高于正常對照組。說明該位點基因型可能是黎族人群血壓升高的危險因素，與報道白種人、日本人人群的基因型GT雜合型與血壓相關(guān)符合〔7〕。

G8002A是第 4 個內(nèi)含子上 G-A 轉(zhuǎn)換突變位點。黎族EH組G8002A位點上的AA基因型高于正常對照組，進(jìn)一步分析G8002A位點上的A等位基因分布頻率高于正常對照組正常對照組提示A等位基因可能是黎族EH的危險因素。

綜上，本研究選取的三個ET-1多態(tài)位點中，有兩個位點的基因型出現(xiàn)了組間差異，對EH的預(yù)測有一定的參考價值。

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