肌萎縮側(cè)索硬化與變性蛋白關(guān)系的研究進(jìn)展

周益毅 綜 述 徐仁伵 審 校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，江西 南昌 330006)

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種以上、下運(yùn)動(dòng)元神經(jīng)受損為特征性表現(xiàn)的成年人起病的神經(jīng)退行性疾病，其導(dǎo)致進(jìn)行性肌無力和萎縮，并最終導(dǎo)致患者在發(fā)病3～5年后死亡。其中約有5%～10%的ALS患者具有家族遺傳史，被稱為家族型ALS(FALS)，其余90%～95%被稱為散發(fā)性ALS(SALS)。目前認(rèn)為多種通路例如氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和聚集、谷氨酸興奮性毒性作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞骨架的改變、軸突運(yùn)輸功能異常、RNA代謝異常、泛素蛋白酶體的異常、肌肉神經(jīng)接點(diǎn)異常、免疫缺陷、神經(jīng)炎癥等都在ALS的發(fā)病中起到重要作用〔1〕。其中研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白質(zhì)在ALS患者體內(nèi)存在異常表達(dá)，如空間結(jié)構(gòu)異常、過量表達(dá)、磷酸化、泛素化、異常聚集和分布等，這些都可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的代謝異常，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性變，這一類蛋白被稱作“變性蛋白”。目前，已經(jīng)明確與ALS相關(guān)的變性蛋白包括：SOD1(Cu/Zn超氧化物歧化酶)、Tau蛋白、TDP43(TAR DNA結(jié)合蛋白43)、FUS/TLS(肉瘤融合/脂肪肉瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、VAPB(囊泡相關(guān)蛋白B)等。本文對(duì)此作一綜述。

1 SOD1

人類編碼SOD1的基因位于21號(hào)染色體上的21q22.1-22.2，其中包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子；全長約11 kb。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)至少160種變異型，包括錯(cuò)義、缺失、插入等，其中大部分導(dǎo)致ALS的SOD1變異為錯(cuò)義突變，這些突變位點(diǎn)分布于整個(gè)SOD1基因序列上。盡管大多數(shù)變異都導(dǎo)致SOD1活性降低，但仍有p.Gly38Arg(Gly37Arg)，p.Ala90Val(Ala89Val)and p.Asp91.Ala(Asp90Ala)等變異型的SOD1活性幾乎正常〔4〕。由于不同基因的突變導(dǎo)致各種變異型SOD1在結(jié)構(gòu)及功能上存在的顯著差異，有研究就依據(jù)SOD1的活性、金屬含量及蛋白質(zhì)光譜等生化特性將SOD1突變體分為金屬結(jié)合區(qū)域SOD1突變體和類野生型SOD1突變體兩種，而且發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致ALS的SOD1突變多屬于金屬結(jié)合區(qū)域SOD1突變體〔2〕。

SOD1是第一個(gè)被確定與FALS發(fā)病相關(guān)的蛋白。約20%的FALS患者中存在SOD1的變異。各種SOD1變異的轉(zhuǎn)基因小鼠也是目前應(yīng)用最多的ALS動(dòng)物模型。對(duì)于變異的SOD1是如何導(dǎo)致ALS的發(fā)生，仍不是很清楚。起初有研究認(rèn)為由于SOD1的變異導(dǎo)致其減弱或喪失了超氧化物清除活性，從而導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基的大量堆積而引起神經(jīng)細(xì)胞的變性或死亡。而研究發(fā)現(xiàn)敲除編碼SOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠并不會(huì)出現(xiàn)類似人類ALS樣表現(xiàn)。而表達(dá)人類變異的SOD1的轉(zhuǎn)基因鼠則出現(xiàn)了類似人ALS樣癥狀。所以認(rèn)為變異的SOD1的毒性作用可能是由于變異的SOD1獲得了一些新的毒性功能，而非正常的SOD1的功能的減弱或缺失。目前突變的SOD1的神經(jīng)毒性作用主要有以下幾個(gè)方面。(1)變異SOD1的氧化損傷：由于變異的SOD1蛋白其活性中心的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致NO、H2O2等異常底物進(jìn)入活性中心并發(fā)生氧化反應(yīng)，進(jìn)而造成細(xì)胞的氧化損傷。研究還發(fā)現(xiàn)共表達(dá)野生型SOD1和變異型SOD1可以提早轉(zhuǎn)基因鼠的發(fā)病時(shí)間并使其病程加速。這說明野生型SOD1同樣在ALS的病理中起到重要的作用〔5〕。(2)SOD1的錯(cuò)誤折疊和異常聚集：細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的異常聚集是包括ALS在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病的顯著病理學(xué)標(biāo)志。通過對(duì)SALS、FALS患者的尸檢病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其脊髓中存在SOD1陽性蛋白包涵體。在表達(dá)人類FALS的變異小鼠(G93A、G37R)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)了富含SOD1的包涵體。因此認(rèn)為變異SOD1的異常聚集是其獲得性細(xì)胞毒性的重要機(jī)制之一。研究已經(jīng)證實(shí)，變異的SOD1其亞基的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致其容易發(fā)生異常折疊，而異常折疊的SOD1則會(huì)加速其自身及其他蛋白的聚集〔6〕。但是否這些聚集物真的存在細(xì)胞毒性呢？最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，變異SOD1的相對(duì)溶解度及錯(cuò)誤折疊程度與其細(xì)胞毒性正相關(guān)，即溶解度或錯(cuò)誤折疊程度越高的變異SOD1蛋白，其細(xì)胞毒性越高；并認(rèn)為SOD1蛋白的聚集是減低其溶解度并隔離有毒性的SOD1的細(xì)胞自我保護(hù)過程〔7〕。(3)導(dǎo)致線粒體形態(tài)及功能異常：通過對(duì)ALS患者及表達(dá)變異的SOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠的線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)線粒體棘突出現(xiàn)空泡化，變異的SOD1會(huì)優(yōu)先結(jié)合到線粒體內(nèi)膜上，從而阻礙線粒體的呼吸作用，降低Ca2+緩沖容量，抑制Bcl-2(B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡〔8〕。變異的SOD1蛋白也被發(fā)現(xiàn)存在于線粒體膜間隙、線粒體基膜及外膜上。在一些研究中，還觀察到在表達(dá)突變的SOD1的轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)細(xì)胞中線粒體的順行及逆行性軸索運(yùn)輸均有損害，這可能導(dǎo)致線粒體在神經(jīng)元內(nèi)的分布異常，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性變。而Magrane〔9〕的實(shí)驗(yàn)也證明軸索順向和逆向運(yùn)輸?shù)臏p少會(huì)增加線粒體的破碎和神經(jīng)元的死亡。不僅如此，變異的SOD1蛋白對(duì)線粒體的影響還可能包括：變異的SOD1在線粒體內(nèi)異常聚集、導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常、線粒體膜電位缺失、破壞鈣穩(wěn)態(tài)及線粒體分裂和融合平衡紊亂等〔10〕。值得注意的是，目前有研究發(fā)現(xiàn)SIRT3(線粒體乙?；?抗體)和PGC-1ɑ(過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子-1α)蛋白有助于對(duì)抗SOD1 G93A變異導(dǎo)致的線粒體破碎及細(xì)胞死亡〔8〕。這可能為減緩ALS的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性變提供了一個(gè)新的策略。

2 Tau蛋白

Tau蛋白是一種廣泛存在于神經(jīng)元中的微管結(jié)合蛋白。人類Tau基因位于染色體17 q21上，全長大約133.9 kb，至少包括16個(gè)外顯子。在成人大腦中，又因外顯子2、3、10的選擇性剪切導(dǎo)致Tau基因產(chǎn)生6中不同亞型：0N3R、0N4R、1N3R、1N4R、2N3R和2N4R，而這些亞型又根據(jù)是否存在10號(hào)外顯子分為3 R-Tau和4 R-Tau亞型。在成人大腦中3 R和4 R幾乎是等量的；而在胎兒大腦中，只有最短的(0N3R)被表達(dá)。由于4R亞型較3R亞型對(duì)微管具有更強(qiáng)的親和力和穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致胎兒神經(jīng)元中的微管更具有活性和可塑性，而成人神經(jīng)元中微管則更具有穩(wěn)定性〔11〕。

通過質(zhì)子光譜法發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白天然展開，并不具有如α-螺旋或β-折疊的任何二級(jí)結(jié)構(gòu)。Tau蛋白主要包括4個(gè)區(qū)域：N-末端的酸性區(qū)域、C末端區(qū)域、富脯氨酸區(qū)域及由9-12號(hào)外顯子編碼的微管結(jié)合域(MBDs)，該區(qū)域包括了4個(gè)不完全的18-氨基酸重復(fù)序列——R1、R2、R3、R4。Tau蛋白通過促進(jìn)微管蛋白形成微管、維持其穩(wěn)定性從而維持正常神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功能。Tau蛋白還在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性、細(xì)胞周期的調(diào)控上起到重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)Tau基因的突變、mRNA的異常剪切及異常的翻譯后修飾(如：過度磷酸化)都可能導(dǎo)致Tau蛋白病。引起Tau蛋白病的基因突變多位于微管結(jié)合區(qū)的10號(hào)外顯子上，該區(qū)域的基因突變直接影響了Tau蛋白與微管蛋白及其他蛋白的結(jié)合能力，從而影響細(xì)胞骨架的正常功能及其穩(wěn)定性。而mRNA的異常剪切則主要影響了4R-Tau與3R-Tau的比例〔12〕，從而可能導(dǎo)致Tau相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。這主要是因?yàn)?R-Tau不僅具有更強(qiáng)的微管結(jié)合能力，而且較3R-Tau更具有聚集傾向，且研究證實(shí)在神經(jīng)纖維纏結(jié)和胞質(zhì)聚集物中發(fā)現(xiàn)更多的4R-Tau。Tau蛋白的翻譯后修飾包括磷酸化、糖基化、糖化、泛素化、硝化、去頂端等等。而目前，Tau蛋白的過度磷酸化是研究最為廣泛且已經(jīng)證實(shí)其在Tau蛋白病中起到了重要的作用。目前在Tau蛋白上至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)45個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中大部分為絲氨酸和蘇氨酸殘基〔13〕。而Tau蛋白的過度磷酸化則可能是蛋白激酶和磷酸化酶的調(diào)節(jié)異常所致。過度磷酸化的Tau蛋白具有高度的聚集傾向，從而形成PhF(成對(duì)螺旋纖維細(xì)絲)、SF(直纖維絲)等聚集物〔14〕，并進(jìn)一步形成諸如AD等神經(jīng)退行性疾病中典型病理學(xué)表現(xiàn)NFT(神經(jīng)纖維纏結(jié))。而由于過度磷酸化的Tau蛋白影響Tau蛋白和其他微管集合蛋白與微管的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致微管及細(xì)胞骨架功能紊亂、阻礙軸索的運(yùn)輸作用，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元和皮質(zhì)軸突的病理性改變。

由于Tau蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白，因此當(dāng)細(xì)胞外或腦脊液中出現(xiàn)多量的Tau蛋白，則可能提示皮質(zhì)軸突的退化和神經(jīng)元的死亡〔15〕。在Blennow等〔16〕的研究中發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液中Tau蛋白較對(duì)照組增高了近3倍，并且靈敏度和特異度都在80%～90%。雖然在AD和其他神經(jīng)退行性疾病的腦脊液Tau蛋白比較中特異度有所下降，但腦脊液Tau含量仍可作為AD等神經(jīng)退行性疾病的診斷和評(píng)定病情程度的一個(gè)重要指標(biāo)。Tau蛋白與AD、FTD等神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)性已得到證實(shí)，但其與ALS的關(guān)系及作用機(jī)制尚不清楚。最近一個(gè)大規(guī)模的臨床研究發(fā)現(xiàn)，引起額顳葉癡呆的Tau編碼基因MAPT的變異并不與ALS相關(guān)，而且SOD1小鼠研究中也發(fā)現(xiàn)Tau蛋白的表達(dá)水平不會(huì)影響小鼠的運(yùn)動(dòng)功能而出現(xiàn)類似人類ALS樣的表現(xiàn)〔17〕。值得注意的是，雖然研究證實(shí)腦脊液中Tau蛋白含量過高提示存在諸如AD、FTD等神經(jīng)退行性疾病可能，但在對(duì)比了57例SALS患者和對(duì)照組的腦脊液Tau含量后發(fā)現(xiàn)，兩者并無顯著差異〔18〕。因此腦脊液Tau尚不能作為診斷ALS的標(biāo)記物。但研究發(fā)現(xiàn)伴隨認(rèn)知功能障礙的ALS(ALSci)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中卻發(fā)現(xiàn)廣泛存在的過度磷酸化的Tau蛋白沉積物。由于Tau蛋白多位于大腦額葉、顳葉、海馬和嗅區(qū)神經(jīng)元以及外周神經(jīng)的軸突內(nèi)。因此Tau蛋白異常多表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。Tau蛋白的異常是否與ALS或者與ALS的部分特殊類型有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 TDP43

1996年人們在研究HIV的轉(zhuǎn)錄因子時(shí)首次發(fā)現(xiàn)TDP-43蛋白，但直到2006年人們才注意到其作為一種重要的標(biāo)志性蛋白存在于神經(jīng)退行性疾病中，包括ALS、FTLD(額顳葉癡呆)等〔19〕。TAR DNA結(jié)合蛋白43(TDP43)是由人類1號(hào)染色體1p36.2上的TARDBP基因編碼的由414個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。 TDP-43廣泛存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，有研究發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中約90%的TDP-43蛋白存在于細(xì)胞核中，只有少量存在于細(xì)胞胞漿中〔20〕。TDP43被認(rèn)為是維持細(xì)胞正常生理代謝和基因正常表達(dá)過程所必需的一種DNA/RNA結(jié)合蛋白。編碼TDP43的TARDBP基因由6個(gè)外顯子組成，其中包括5個(gè)編碼子和1個(gè)非編碼子。目前發(fā)現(xiàn)的TDP43相關(guān)的基因突變主要存在于TARDBP基因上，且目前已知的40余種突變形式大都為其6號(hào)外顯子上的錯(cuò)譯變異。TARDBP基因變異約占家族型ALS的4%和SALS的1.5%，但與該基因相關(guān)的ALS患者大都表現(xiàn)出典型的成人ALS癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)諸如生長因子顆粒蛋白前體(CRN)基因〔21〕、含纈酪肽蛋白(VCP)基因的變異都與異常TDP-43的形成有關(guān)，但目前該兩種基因的變異都只在家族性FTD患者中發(fā)現(xiàn)。在結(jié)構(gòu)上TDP43屬于細(xì)胞核因子家族，其結(jié)構(gòu)性能與hnRNPs類似；不同的是，其包含兩個(gè)RNA結(jié)合基序(RRMs)--RRM1和RRM2〔22〕，使其同時(shí)具有DNA、RNA結(jié)合蛋白功能。但到目前為止對(duì)RRMs的具體結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制尚不十分清楚。同時(shí)TDP43還存在一個(gè)富含甘氨酸的C'末端區(qū)域和N'末端區(qū)域。富含甘氨酸的C'末端區(qū)域主要由TARDBP的6號(hào)外顯子編碼，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明其主要作用包括外顯子跳躍和抑制轉(zhuǎn)錄活性作用，也有實(shí)驗(yàn)表明C'末端可以引起聚集物和淀粉樣纖維蛋白的形成〔23〕。相比對(duì)N'末端區(qū)域的研究較少，但目前最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)N'末端區(qū)域(NTD)為一個(gè)富含β-strands區(qū)，其中包含核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS)，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)未知結(jié)構(gòu)域，其可能存在促進(jìn)聚集反應(yīng)作用〔24〕。而且，NTD也能增強(qiáng)兩種RRMs對(duì)單鏈(TG)6DNA的結(jié)合力，這表明NTD可能間接調(diào)節(jié)TDP43的核酸結(jié)合力。TDP43除了在基因的轉(zhuǎn)錄和剪切過程上起到了重要的調(diào)節(jié)作用，還在mRNA的合成、維持mRNA的穩(wěn)定、細(xì)胞的凋亡及分裂、神經(jīng)元可塑性的調(diào)節(jié)、維持樹突完整性中起到了重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在敲除了TDP43基因的細(xì)胞上會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核形態(tài)及細(xì)胞周期異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞的過早死亡〔25〕。類似的結(jié)果也同樣在敲除TDP43基因的小鼠胚胎上得到證實(shí)。這進(jìn)一步說明TDP43是一種存在于正常細(xì)胞中維持細(xì)胞周期及其正常生理代謝所必需的蛋白。但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中過量表達(dá)的TDP43則可能導(dǎo)致細(xì)胞分裂周期的提前停止甚至死亡〔26〕。Noto等〔27〕也已經(jīng)在SALS患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)了異常增高的TDP43水平。同樣在血漿、皮膚組織、骨骼肌組織的樣本中也發(fā)現(xiàn)了異常的TDP43水平或變異的TDP43。在表達(dá)Met337Val變異和Ala315Thr變異的TDP43的轉(zhuǎn)基因鼠上都發(fā)現(xiàn)了類似人類ALS的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)變性〔28〕。其原因可能是由于變異型TDP43的C末端區(qū)域的異常增殖，從而導(dǎo)致影響了TDP43的RNA/DNA結(jié)合活性，甚至導(dǎo)致TDP43的異常聚集。而且可能由于多泡體(MVB)對(duì)poly-泛素蛋白的降解及胞核輸出功能的損傷，異常聚集的TDP43多存在于細(xì)胞胞漿中。而異常聚集且異位的TDP43包涵體能夠?qū)е录?xì)胞的泛素化、磷酸化和毒性作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞的退變甚至死亡。而基因的變異、長期反復(fù)的應(yīng)激狀態(tài)等多種原因都可能導(dǎo)致TDP43的異常聚集〔29〕。通過免疫印跡分析法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TDP43存在于ALS患者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的泛素包涵體中。綜上所述，TDP-43蛋白導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退行性變有多種原因，包括其過量表達(dá)、基因變異、異常聚集、泛素化等，且相互之間都存在某種關(guān)聯(lián)。雖然目前對(duì)于TDP43是如何調(diào)節(jié)基因的表達(dá)以及在諸如ALS和FTLD的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中的詳細(xì)作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，且其作為一種生物標(biāo)志物對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的診斷、預(yù)后及可能的治療都有著重要的意義。

4 FUS/TLS

2009年有人在對(duì)ALS患者的TDP43包涵體研究時(shí)發(fā)現(xiàn)存在另一種DNA/RNA結(jié)合蛋白的基因變異，并通過測序發(fā)現(xiàn)其是位于FUS/TLS基因上的一個(gè)顯性錯(cuò)義突變(R521C)。人類FUS/TLS是一個(gè)由15個(gè)外顯子編碼的526個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其編碼基因定位于16號(hào)染色體16q12上，其特征型結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為富含甘酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸殘基的N末端區(qū)域，一個(gè)富于精氨酸區(qū)域，一個(gè)RNA識(shí)別序列(RRM)，多重精氨酸/甘氨酸/甘氨酸(RGG)重復(fù)的精氨酸和甘氨酸富集區(qū)域和一個(gè)保守的C末端鋅指結(jié)構(gòu)。

FUS/TLS與TDP43同樣都屬于DNA/RNA結(jié)合蛋白，在生理?xiàng)l件下主要存在于細(xì)胞核中，在胞質(zhì)中的水平較低〔30〕。FUS/TLS主要參與基因表達(dá)的調(diào)控：轉(zhuǎn)錄、RNA剪切、RNA運(yùn)輸和翻譯，還可能在mRNA的加工以及維持基因組完整性中起到重要的作用〔31〕。FUS/TLS能夠與許多細(xì)胞核激素受體以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合如Spi-1/PU1(特異性蛋白-1/富含嘌呤眶-1)和NF-KB(核因子-KB)。并通過與RNA聚合酶Ⅱ以及TFⅡD復(fù)合體的相互作用影響轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)及啟動(dòng)子的選擇〔32〕。FUS/TLS還可以通過抑制RNAPIII基因的轉(zhuǎn)錄從而影響RNA的加工。當(dāng)DNA損傷時(shí)，F(xiàn)US/TLS可通過5'非轉(zhuǎn)譯區(qū)周期蛋白的反義非編碼RNA募集對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。

目前認(rèn)為FUS/TLS導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的原因可能是由于喪失其正常功能和獲得了新的細(xì)胞毒性。由于FUS/TLS在基因表達(dá)調(diào)控中起到重要的作用，因此，認(rèn)為在ALS相關(guān)變異可能影響了RNA的代謝，并擾亂了核定位信號(hào)的功能，導(dǎo)致FUS/TLS異常聚集于胞質(zhì)中〔33〕。在存在FUS/TLS變異的病人尸檢中發(fā)現(xiàn)其腦和脊髓的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中存在異常的FUS/TLS陽性包涵體〔34〕。這一觀察結(jié)果與ALS患者神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)存在TDP43包涵體類似，但筆者發(fā)現(xiàn)FUS/TLS包涵體對(duì)TDP43不具有免疫反應(yīng)性，這意味著FUS/TLS變異與TDP43異常聚集驅(qū)使的神經(jīng)退行性變是相互獨(dú)立的病理機(jī)制〔35〕。不同于TDP43，F(xiàn)US/TLS包涵體的過度磷酸化及泛素化也極為少見。但值得注意的是，最近一項(xiàng)用酵母細(xì)胞表達(dá)FUS的研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)FUS的酵母細(xì)胞碎片被碘化丙啶染色而沒有檢測到蛋白的聚集，提示FUS的表達(dá)導(dǎo)致的膜損害和細(xì)胞損害的發(fā)生要早于異常蛋白的聚集，并認(rèn)為聚集物的形成可能起到保護(hù)細(xì)胞免受FUS毒性損害的作用〔33〕。另一項(xiàng)究發(fā)現(xiàn)，失去FUS/TLS的遠(yuǎn)交成年鼠，并不會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變〔36〕。這提供了重要的證據(jù)表明FUS/TLS功能的喪失并不是導(dǎo)致其致病的關(guān)鍵機(jī)制。因此對(duì)于變異的FUS/TLS是如何產(chǎn)生細(xì)胞毒性以及在ALS的發(fā)病機(jī)制中是否與TDP43相關(guān)聯(lián)都有待進(jìn)一步研究。

5 VAPB

VAPB屬于高度保守的VAP蛋白家族，是一種 II型膜內(nèi)蛋白，其主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(ER)。主要結(jié)構(gòu)包括一個(gè)MSP氨基末端區(qū)域，一個(gè)中心螺旋序列和一個(gè)羧基跨膜區(qū)域固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上〔37〕。目前研究發(fā)現(xiàn)VAPB在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)肌肉接點(diǎn)終端膨大的形成、Ca2+的穩(wěn)態(tài)都起到重要作用。VAPB可能還參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激以及未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2種VAPB的錯(cuò)義突變(P56S,T46T)與家族型ALS相關(guān)，這兩種變異都能夠?qū)е鲁砻艿?、不可溶的胞質(zhì)VAPB的聚集物形成〔38〕。研究發(fā)現(xiàn)變異型和過度表的野生型hVAPB可能損傷蛋白酶體的功能，并增加泛素和泛素樣偶聯(lián)物的負(fù)擔(dān)〔39〕。通過與20S蛋白酶體相互作用，從而可能導(dǎo)致UPS的損傷。而且變異VAPB聚集物的出現(xiàn)多伴隨異常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的形成和無效的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。但在一項(xiàng)最新的研究中。發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)VAPB P56S變異的小鼠，在其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中產(chǎn)生大量的VAPB聚集物，但小鼠卻并未表現(xiàn)出任何類似人類ALS的癥狀表現(xiàn)，也不影響小鼠的正常壽命，而且表達(dá)變異型VAPB并不改變SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的疾病病程〔40〕。因此使人們對(duì)VAPB聚集物是否真的與ALS發(fā)病機(jī)制相關(guān)以及VAPB究竟通過何種途徑導(dǎo)致神經(jīng)元的退變產(chǎn)生了疑問。不過在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)表達(dá)變異型VAPB P56S可能通過影響Ca2+穩(wěn)態(tài)和 Miro1/kinesin-1與微管蛋白的相互作用從而擾亂順行性線粒體軸索運(yùn)輸〔41〕。這說明VAPB可能與SOD1類似同樣具有影響線粒體軸索運(yùn)輸?shù)墓δ?。但其在ALS的發(fā)病中的具體作用仍有待研究。

6 小 結(jié)

通過對(duì)這些蛋白的綜合分析不難看出，他們都具有一些共同的特點(diǎn)：①多參與生物體內(nèi)的重要代謝作用，或起到維持細(xì)胞正常生理功能的作用；②當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生變異或過度表達(dá)時(shí)多易形成不溶的聚集物或包涵體；③變性后的蛋白質(zhì)多存在一些機(jī)制尚不明確的獲得性細(xì)胞毒性，從而影響細(xì)胞的正常功能，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性變。而現(xiàn)在越來越多的研究對(duì)聚集物和包涵體是否會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的退行性變提出質(zhì)疑，多項(xiàng)最新的研究都提出聚集物的形成可能對(duì)神經(jīng)元是無害的，甚至可能起到隔離可溶性細(xì)胞毒性物質(zhì)的細(xì)胞保護(hù)作用。而這與人們之前的認(rèn)識(shí)大相徑庭。因此仍有待對(duì)這些包涵體和異常蛋白聚集物的毒性機(jī)制進(jìn)一步研究。盡管如此，這些蛋白質(zhì)聚集物或包涵體作為一種重要的病理學(xué)標(biāo)記物，用以推測疾病的進(jìn)程以及預(yù)后仍有著重要的意義。而這些ALS相關(guān)的變性蛋白在ALS發(fā)病中的確切毒性機(jī)制以及如何對(duì)這些蛋白的表達(dá)的調(diào)控而對(duì)ALS以及其他神經(jīng)退行性疾病進(jìn)行治療仍有待研究。

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