不同壓力高壓氧對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠模型血腫周圍水腫及MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響

李中華 張 賀 劉 冰 李國輝 房紹偉

(濰坊醫(yī)學(xué)院外科教研室，山東 濰坊 261053)

研究認(rèn)為發(fā)生腦出血后，在血腫周圍通常會形成組織損傷及水腫進(jìn)行性加重區(qū)域。同時，腦出血癥狀發(fā)生后，患者神經(jīng)功能惡化與血腫周圍組織產(chǎn)生的繼發(fā)性損傷有一定聯(lián)系〔1〕。對于凝血酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9在腦出血之后的相關(guān)作用已被公認(rèn)。然而，但對于MMP抑制劑(TIMP)-1的聯(lián)合研究較少〔2〕。目前在臨床上應(yīng)用高壓氧預(yù)防腦出血水腫已有一定進(jìn)展，但對于壓力的選擇有所爭議。本文采用不同壓力高壓氧治療實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠，研究其對血腫周圍水腫情況以及血腫周圍MMP-9及TIMP-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動物 選取我院實(shí)驗(yàn)中心SPF級成年健康SD大鼠90只，均為雄性。體重300～355 g，平均(325.7±3.6)g。采用標(biāo)準(zhǔn)化分籠飼養(yǎng)。建模后以數(shù)字法隨機(jī)分成對照組18例(ICH組，常規(guī)腦出血模型，不進(jìn)行處理)；常壓氧組18例(ICH 1.0 ATA組)；高壓氧組54例，依照不同壓力分為：ICH 1.8 ATA組、ICH 2.0 ATA組、ICH 2.2 ATA組各18例。各組分別在治療后1、3、5 d行斷頭取腦處理，每時間點(diǎn)6只。在制模成功之后24 h依照不同的壓力治療1次/d，常壓氧組及高壓氧組在治療壓力上有區(qū)別外，另同時予以吸入濃度90%的氧氣。

1.2模型制備 通過膠原酶Ⅶ(購自上?；鈱?shí)業(yè)有限公司)注射誘發(fā)尾殼核腦的出血模型。對大鼠進(jìn)行稱重后，以10%的水合氯醛(劑量為0.4 ml/100 g)行腹腔內(nèi)注射，確保手術(shù)時大鼠可自主呼吸，將其俯臥固定在立體定位儀，并使其前后囟處在同一水平。常規(guī)備皮和消毒，在顱正中處行矢狀切口1.5 cm，以鹽水棉球輕擦，暴露前囟，在前囟后約1 mm，矢狀線的右側(cè)3 mm經(jīng)尖頭改錐在顱骨上鉆孔，直徑大約1 mm，深達(dá)骨膜。在立體定位儀上垂直固定含0.6 U的膠原酶Ⅶ以及3 μl生理鹽水的微量注射器。確保針頭和小孔處于同一直線，進(jìn)針大約6 mm，勻速推注約5 min，并留針10 min。再緩慢出針5 min，總計(jì)20 min。最后以骨蠟將顱孔封閉，縫合、消毒，放置空籠內(nèi)至大鼠蘇醒。

1.3制模成功的判定〔3〕模型制備24 h后仔細(xì)觀察大鼠的行為學(xué)變化。依照Longa評分法評定，0分：無體征；1分：無法完全伸展對側(cè)肢體(即左側(cè))；2分：對側(cè)肢體已癱瘓，且向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，可發(fā)生追尾；3分：無法站立且倒向?qū)?cè)；4分：意識障礙。2分以上即可判定為造模成功。

1.4加壓方法 大鼠在造模成功之后即可進(jìn)艙治療，將其放置于特制木箱(上蓋是玻璃)內(nèi)，箱底有供氧管進(jìn)口，而對角箱底亦設(shè)置出氣口。木箱放置艙中，壓力依照分組設(shè)定，分別加壓約30 min，在壓力達(dá)到穩(wěn)壓前的5 min予以直排式供氧，流量設(shè)定為10 L/min，開始供氧，使其穩(wěn)壓吸入60 min后終止供氧?？砷_始勻速增減壓速率設(shè)定為0.01 mPa/min，減壓時間為30 min，1次/d。經(jīng)觀察窗對艙內(nèi)大鼠行為進(jìn)行觀察記錄，常壓氧不加壓，對照組不進(jìn)行相應(yīng)治療，其余步驟均同上。

1.5周圍水腫組織的含水量測定 以干濕比重法進(jìn)行測定。先去除額極，取出病變側(cè)約2 mm的腦組織，并將腦組織放于已稱重的錫紙A內(nèi)，之后立刻稱重，所得重量以B表示，B-A為腦組織的濕重。再將腦組織以錫紙包裹，置于烤箱中以120℃烘干8 h后取出?；謴?fù)至室溫稱重，記為C，C-A為干重。含水量=(B-C)/(B-A)×100%。

1.6MMP-9及TIMP-1水平測定 均以免疫組化法檢測，采用MMP-9、TIMP-1單克隆抗體以及免疫組化試劑盒(購自北京中杉金橋公司)。嚴(yán)格按說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時間腦組織的含水量對比 各組大鼠腦組織的含水量在出血后第3天達(dá)到峰值，而后下降。ICH組與ICH 1.0 ATA組在各時間點(diǎn)對比，含水量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1天時ICH 2.0 ATA組的腦組織水含量顯著少于ICH組和ICH 1.0 ATA組。第3天與第5天時，ICH 1.8 ATA組、ICH 2.0 ATA組和ICH 2.2 ATA組均顯著少于ICH組和ICH 1.0 ATA組；而ICH 2.0 ATA組在第3天和第5天時的腦組織水含量少于ICH 1.8 ATA組以及ICH 2.2 ATA組(均P<0.05)。見表1。

2.2各組血腫周圍MMP-9及TIMP-1表達(dá)水平對比 ICH組與ICH 1.0 ATA組，以及ICH 1.8 ATA組與ICH 2.2 ATA組在第1、3、5天等比較MMP-9及TIMP-1水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但第1、3、5天時ICH 2.0 ATA組的MMP-9水平均分別顯著低于ICH組、ICH 1.0 ATA組、ICH 1.8ATA組和ICH 2.2 ATA組。第1、3天時ICH 2.0 ATA組的TIMP-1水平均顯著高于ICH組、ICH 1.0 ATA組、ICH 1.8 ATA組和ICH 2.2 ATA組(均P<0.05)。見表2。

表1 各組不同時間腦組織含水量對比(%，±s，n=6)

表2 各組血腫周圍MMP-9及TIMP-1表達(dá)水平對比±s,個/H，n=6)

3 討 論

腦水腫作為腦出血發(fā)生后最主要的一種繼發(fā)型病理變化，其嚴(yán)重程度對患者的預(yù)后可產(chǎn)生極大的影響〔4〕。因此，對腦水腫實(shí)施有效治療可緩解患者腦繼發(fā)型損害，從而更好地保護(hù)及促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本研究結(jié)果顯示，相對于其他各組，ICH 2.0 ATA組的治療效果更佳，此壓力參數(shù)可能為臨床所需。究其原因，筆者認(rèn)為可能和以下幾點(diǎn)有關(guān)：(1)高壓氧治療通過提升氧在腦組織中的有關(guān)彌散距離，增加血氧分壓，利于側(cè)支循環(huán)的建立及降低腦血流量和顱內(nèi)壓等諸多途徑使腦水腫組織氧供和血流灌注明顯改善〔5〕。還可阻斷發(fā)生腦出血之后的“缺氧-水腫-缺氧”這一惡性循環(huán)，最終有效減少出血灶四周的腦組織水含量〔6〕。同時，高壓氧還可提升有氧代謝，緩解組織酸中毒，對腦內(nèi)環(huán)境亦有改善作用，降低腦內(nèi)血管通透性，從而減輕水腫癥狀〔7〕。(2)在高壓氧環(huán)境下，腦血流量的氧壓為2.0 ATA時，其隨動脈氧分壓水平的上升逐漸下降，而若氧壓>2.0 ATA，腦血流量水平又會趨于增加。本次研究的1.8 ATA組壓力雖然相對較低，但并未獲得最佳療效，這亦提示氧分壓在選取時不能過低。而2.2 ATA組的壓力更高，效果卻仍然不佳，這可能是由于過高壓力抑制了腦對糖類的攝取、影響腦內(nèi)糖代謝，增大了腦血流量從而誘發(fā)腦出血〔8〕。有報(bào)道證實(shí)〔9〕，腦血腫清除的患者若處于>2.0 ATA的壓力治療下，容易發(fā)生頭痛加劇、術(shù)中減壓窗張力上升以及腦組織膨出顯著等癥狀；若壓力降為2.0 ATA時，上述情況逐漸好轉(zhuǎn)。因此，筆者認(rèn)為，對腦出血合并腦水腫者，壓力治療應(yīng)以2.0 ATA為分界線。(3)在MMP-9及TIMP-1水平方面，二者產(chǎn)生上述變化的原因可能是ICH后，常規(guī)通過酶原-抑制劑的復(fù)合物形式共存的MMP-9和TIMP-1等物質(zhì)發(fā)生解離，TIMP-1伴隨MMP-9的表達(dá)水平上升而升高，但表達(dá)程度明顯低于MMP-9，打破了二者間存在的動態(tài)平衡，經(jīng)生化作用導(dǎo)致血管源性腦水腫〔10〕。在高壓氧治療后，不同壓力產(chǎn)生的影響效果不一，但以壓力為2.0 ATA的效果最佳，MMP-9水平整體下降，上調(diào)了TIMP-1水平，調(diào)整了MMP-9及TIMP-1的動態(tài)平衡，進(jìn)而緩解微血管基底膜的膠原降解從而發(fā)揮保護(hù)血腦屏障的效果，最終緩解了神經(jīng)損傷。Yang等〔11〕亦通過研究證實(shí)了高壓氧治療血腫后腦水腫下調(diào)周圍組織的MMP-9及上調(diào)TIMP-1的表達(dá)。

綜上所述，不同壓力的高壓氧對血腫周圍水腫癥狀具有一定的治療作用，但壓力治療應(yīng)以2.0 ATA為分界線。

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