不同數(shù)量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療老年糖尿病大鼠的療效

劉雅娟 郭 麗 張桂英 孫 擎 邵夢(mèng)楠

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

1型糖尿病是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，以胰島β細(xì)胞的破壞為特征，每日注射胰島素可以緩解病情；β細(xì)胞移植也是一種治療方法，但是存在供體不足和免疫排斥的問(wèn)題〔1〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)免疫原性弱，靜脈移植后可以定位在受損部位并分化成該部位的細(xì)胞修復(fù)損傷。以往發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)BMSCs分化成胰島樣細(xì)胞，移植到糖尿病模型大鼠腎被膜下可以治療糖尿病〔2〕。也有研究者發(fā)現(xiàn)BMSCs不分化成胰島樣細(xì)胞，直接靜脈移植也可以治療糖尿病〔3,4〕，但是靜脈移植多少細(xì)胞能有效治療糖尿病報(bào)道較少。本文擬探討不同數(shù)量的BMSCs靜脈移植進(jìn)老年糖尿病大鼠體內(nèi)對(duì)糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar大鼠；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液 (美國(guó)Gibco公司)、帕可爾(Percoll)分離液、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、鏈脲佐菌素(STZ )(美國(guó)Sigma公司)；人白細(xì)胞抗原-B27、胎牛血清、活化素、胰島素、地塞米松(國(guó)產(chǎn))。

1.2胰腺條件培養(yǎng)液制備 20只周齡Wistar大鼠，處死，無(wú)菌條件下取胰腺組織，勻漿器研磨，離心取上清，-70℃反復(fù)凍融，1 500 r/min離心10 min，去上清凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3大鼠BMSCs、分離、擴(kuò)增培養(yǎng)與鑒定 采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)、擴(kuò)增法〔5〕。將周齡大鼠脫臼處死，消毒、無(wú)菌條件下取股骨，用DMEM(低糖)培養(yǎng)液反復(fù)沖洗髓腔，制備單細(xì)胞。加等體積的Percoll分離液，2 000 r/min離心20 min，收集細(xì)胞的界面層，分離的骨髓有核細(xì)胞按1×106/ml的密度接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞置于5%CO2，飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48～72 h后，通過(guò)換液去除懸浮的細(xì)胞，添加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3～4 d換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDAT消化細(xì)胞，傳代。采用FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)直接熒光法，檢測(cè)細(xì)胞表而標(biāo)志，鑒定BMSCs。

1.4體外誘導(dǎo)BMSCs向胰島樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化與鑒定 取第3代BMSCs胰酶消化，制成單細(xì)胞，按2×105/ml分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，接種于6孔板中，使用無(wú)血清低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d。實(shí)驗(yàn)組分別加bFGF、EGF、人白細(xì)胞抗原-B27添加劑、誘導(dǎo)培養(yǎng)6～7 d；然后換用無(wú)血清高糖培養(yǎng)基，添加胰腺條件培養(yǎng)液肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF，10 μg/ml)2%人白細(xì)胞抗原-B27，活化素A(Active A)、巰基乙醇及尼克酰胺，繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d；對(duì)照組不加任何因子。雙硫蹤染色鑒定胰島樣細(xì)胞團(tuán)，將誘導(dǎo)的細(xì)胞用緩沖液沖洗后，加雙硫蹤液，37℃孵箱孵育0 min，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5大鼠糖尿病模型制作 雄性老年Wistar大鼠60只(9月齡)，體重(380±40)g，清潔級(jí)，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，苦味酸標(biāo)記動(dòng)物。其中正常對(duì)照組10只，另外50只進(jìn)行糖尿病造模處理。按60 mg/kg體重尾靜脈1次注射1%STZ溶液，48 h后用血糖儀(強(qiáng)生公司，穩(wěn)豪型)檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖，>13.6 mmol/L、穩(wěn)定5 d為成功模型，共有44只成模。將糖尿病大鼠分成4組：模型組、2×104、2×105、2×106細(xì)胞移植組，每組11只。細(xì)胞移植組經(jīng)球后靜脈分別注入2×104、2×105、2×106個(gè)BMSCs于糖尿病大鼠體內(nèi)，分兩次間隔24 h移植細(xì)胞。移植10 d后，分別檢測(cè)模型鼠的尿糖、血糖，觀察其治療效果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs培養(yǎng) 經(jīng)Percoll分離液分離、細(xì)胞種植24 h后，少量梭形細(xì)胞貼壁, 72 h后貼壁細(xì)胞增多,呈圓形、橢圓形、梭形等。細(xì)胞80%融合后用0.25%胰酶消化傳代后，貼壁細(xì)胞大多呈梭形。流式細(xì)胞儀鑒定所得細(xì)胞表達(dá)CD44、不表達(dá) CD34，表明所得細(xì)胞是骨髓中一群處于未分化狀態(tài)的非造血細(xì)胞的幼稚干細(xì)胞。

2.2誘導(dǎo)BMSCs分化成胰島樣細(xì)胞 加入誘導(dǎo)劑后，BMSCs形態(tài)逐漸發(fā)生變化，由長(zhǎng)梭形變成圓形。誘導(dǎo)1 w后，圓形細(xì)胞增多，并聚集成團(tuán)；2 w 后，部分細(xì)胞團(tuán)呈懸浮狀。透射電子顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化的BMSCs,有類(lèi)似胰島細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的圓形分泌顆粒，線(xiàn)粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體較多。雙硫蹤染色呈亮紅色，鑒定為胰島樣細(xì)胞團(tuán)。

2.3糖尿病模型大鼠鑒定 腹腔內(nèi)注射STZ溶液3 d后，大鼠出現(xiàn)多飲、多食癥狀;1 w后,多數(shù)大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食癥狀。結(jié)果顯示,注射STZ前大鼠血糖值為(5.75±0.64)mmol/L，尿糖值為(2.87±0.85) g/L；注射STZ1 w后分別為(22.35±2.13)mmol/L, (21.23±1.61) g/L。模型動(dòng)物血糖、尿糖值明顯增高，與注射STZ前比較差異顯著(P<0.05)。

2.4不同數(shù)量BMSCs移植后對(duì)糖尿病大鼠血糖、尿糖的抑制作用 當(dāng)移植細(xì)胞量為2×106個(gè)BMSCs時(shí)，尿糖和血糖值顯著下降，顯著低于模型組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 不同細(xì)胞數(shù)量BMSCs移植對(duì)糖尿病大鼠血糖和尿糖的影響±s)

3 討 論

目前關(guān)于糖尿病的治療主要關(guān)注三點(diǎn)：預(yù)防剩余β細(xì)胞的破壞，β細(xì)胞的恢復(fù)以及對(duì)β細(xì)胞的免疫保護(hù)〔6〕。1型糖尿病的治療方法都不夠理想，BMSCs完全可以滿(mǎn)足上述要求。已有研究表明BMSCs能通過(guò)增強(qiáng)胰島的再血管化增強(qiáng)移植胰島的存活和功能〔7,8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以被分階段誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞。許多研究也證明BMSCs可以體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞〔9〕。我們以往將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的胰島樣細(xì)胞可以治療糖尿病，但是誘導(dǎo)試劑較多，成本較大。直接進(jìn)行BMSCs靜脈移植可以減少成本，但是關(guān)于移植的最適合數(shù)量報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2×106的療效最好，能夠有效降低血糖和尿糖。

4 參考文獻(xiàn)

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