雷帕霉素對(duì)早期糖尿病大鼠腎臟TGF-β1、FN表達(dá)的影響

李琳琳 鄭祥雄

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院免疫研究所，福建 福州 350001)

早期糖尿病腎病(DN)主要表現(xiàn)為腎小球及腎小管的肥大、基底膜的增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常聚集。已有研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是一個(gè)對(duì)腎臟肥大及ECM聚積均發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子。纖維連接蛋白(FN)是ECM的主要成分之一。雷帕霉素是一種免疫抑制劑。近年研究提示，雷帕霉素能抑制單腎切除所誘導(dǎo)的殘余腎臟肥大〔1〕，還能抑制系膜細(xì)胞增殖及Ⅳ型膠原的合成〔2〕。由于單側(cè)腎切除所致代償性腎肥大與糖尿病狀態(tài)下腎肥大具有一定相似性，并且系膜細(xì)胞的增殖及ECM的聚集都是DN發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，本研究擬通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)DN大鼠模型，用雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)治療，通過觀察糖尿病大鼠腎臟病理變化及TGF-β1 、FN表達(dá)的變化，來初步探討雷帕霉素對(duì)糖尿病腎臟保護(hù)功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重180～250 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2DN病模型的建立及分組 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組8只(C組)與DM組16只，糖尿病組禁食12 h后一次性腹腔注射1%STZ(瑞士ALEXIS公司) 75 mg/kg體重。注射后72 h及1、2、4 w末內(nèi)眥靜脈取血測(cè)血糖。血糖>16.7 mmol/L、尿糖強(qiáng)陽性者作為糖尿病模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)，不達(dá)標(biāo)者退出實(shí)驗(yàn)。將16只DM大鼠再分為DM雷帕霉素干預(yù)組8只(DN+RAP組)與非干預(yù)組8只(DN組)。DN+RAP組從第5周起予雷帕霉素1 mg·kg-1·d-1灌胃治療，C組與DN組每天經(jīng)口灌胃等量溶媒0.5%羧甲基纖維素直至第12周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3主要試劑 STZ(瑞士 ALEXIS公司)，用前溶于0.1 mol/L的無菌枸櫞酸緩沖液中，pH4.4。兔抗大鼠TGF-β1 系美國(guó)SANTA CRUZ公司產(chǎn)品，兔抗大鼠FN 系LAB VISION公司產(chǎn)品，山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(二步法免疫組化試劑)、DAB均系北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。Trizol,美國(guó)Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×倍緩沖液、dNTP均系Fermentas公司產(chǎn)品。TGF-β1、β-actin 引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.4觀察指標(biāo)和測(cè)定方法

1.4.1生化指標(biāo)檢測(cè) 血、尿肌酐采用自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，Ualb采用貝克曼特定蛋白分析儀檢測(cè)(免疫比濁法)，計(jì)算出體重校正的內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。

1.4.2腎組織病理檢查 蠟塊切3 μm薄片，分別行HE、PAS、PASM 染色。光鏡下觀察HE、PAS、PASM染色切片的腎組織形態(tài)學(xué)改變。在400倍放大倍數(shù)下，每張HE切片按順時(shí)間方向隨機(jī)選取20個(gè)正切的腎小球，應(yīng)用圖像軟件分析系統(tǒng)(Image-Pro-Plus6.0)計(jì)算每個(gè)正切腎血管球的直徑(RG)、面積(AG)、體積(VG)。同樣方法下分析PASM切片，計(jì)算每個(gè)腎小球PASM染色陽性面積與腎小球面積比，最后求20個(gè)小球此比值的均數(shù)，即為每張切片的系膜基質(zhì)擴(kuò)張指數(shù)(MMEI)。

1.4.3免疫組化二步法觀察FN、TGF-β1蛋白在腎組織的定位和表達(dá) 切片厚度3 μm，常規(guī)脫蠟至水，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，分別加入FN(1∶100)、TGF-β1 (1∶100)多克隆抗體(一抗)37℃孵育，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照；分別加入相應(yīng)的二抗，DAB顯色。在高倍鏡下(×400)每張切片選取30個(gè)腎小球分別攝片，應(yīng)用圖像軟件分析系統(tǒng)(Image-Pro-Plus6.0)分別計(jì)算每個(gè)腎小球上FN、TGF-β1表達(dá)的整合光密度及相應(yīng)的腎小球面積，兩者比值即為每個(gè)腎小球FN、TGF-β1 表達(dá)的腎小球指數(shù)，計(jì)算30個(gè)腎小球此比值均數(shù)，即為每張切片F(xiàn)N 、TGF-β1陽性表達(dá)的腎小球指數(shù)。

1.4.4RT-PCR檢測(cè)FN、TGF-β1mRNA表達(dá) 采用Trizol 試劑提取腎皮質(zhì)總RNA。調(diào)整各標(biāo)本RNA濃度一致。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,在Taq多聚酶催化下,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TGFβ1引物序列上游:GCACCATCCATGACATGAAC，下游:CCTTGCTGTACTGTGTGTCCA，產(chǎn)物：272 bp。 FN引物序列上游：CCGGGTTCTGAGTACACAGTC，下游：AGGGACCACTTCTCTGGGAGG，產(chǎn)物：768 bp 。β-actin引物序列上游：CATCCTGCGTCTGGACCT，下游:TCAGGAGGAGCAATGATCTTG，產(chǎn)物：475 bp。TGF-β1反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性40 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72℃終末延伸10 min,共35循環(huán)。 FN反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性40 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,72 ℃終末延伸10 min,共35循環(huán)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)和Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般生化指標(biāo) DN+RAP組及DN組較C組體重減輕，血糖、尿量明顯增加(P<0.01),24 h Ualb、體重校正的Ccr也明顯升高，表明DN建模成功。DN+RAP組24 h Ualb、Ccr較DN組降低(P<0.05)。DN+RAP組與DN組大鼠血糖比較無差異。見表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)變化±s,n=8)

2.2腎組織病理檢查結(jié)果 與C組相比，DN組腎重/體重顯著增大，DN+RAP組腎重/體重較DM組減小，但還未降至C組水平。PAS切片上，DN組腎小球明顯增大，伴球囊腔擴(kuò)大,表現(xiàn)為正切面積、腎小球體積較C組明顯增大(P<0.01),DN+RAP組腎小球正切面積、腎小球體積較DN組降低(P<0.01)。見表2。DN組大鼠小血管玻璃樣變，腎小球系膜基質(zhì)增多，基底膜增厚，EMMI較C組增大，DN+RAP組EMMI較DN組降低(P<0.01)。見圖1。

表2 各組大鼠腎小球平均面積、體積、EMMI的變化±s，n=8)

圖1 三組大鼠腎組織病理變化(PAS染色，×400)

2.3TGF-β1、FN在腎組織的定位和表達(dá) C組TGF-β1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，呈淺黃色，少量表達(dá)于腎小球。12 w末DN組大鼠TGF-β1表達(dá)較C組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，在腎小球呈索條狀分布，呈棕黑色，染色深，腎小管及腎間質(zhì)表達(dá)也明顯增強(qiáng)。DN+RAP組TGF-β1表達(dá)較DN組下調(diào)(P<0.05)。見表3，圖2。FN主要定位于腎小球系膜基質(zhì)及基底膜，腎小管間質(zhì)亦有少量表達(dá)。C組腎小球內(nèi)可見散在的棕黃色陽性染色，著色淺。DN組較C組FN蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，在腎小球內(nèi)呈密集條索狀著色。DN+RAP組腎小球內(nèi)陽性染色較DN組減輕(P<0.01)。見表3，圖3。

2.4腎組織中TGF-β1、FN mRNA的表達(dá) DN組TGF-β1 mRNA較C組明顯升高(P<0.01)，DN+RAP組TGF-β1 mRNA表達(dá)量較DN組顯著下降(P<0.01)，但其表達(dá)仍然高于C組(P<0.05)。C組大鼠腎組織FN低表達(dá)， DN組FN較C組表達(dá)明顯升高(P<0.01)，DN+RAP組FN mRNA的表達(dá)量顯著低于DN組(P<0.01)。見表3，圖4。

圖2 各組大鼠腎組織中FN蛋白表達(dá)的變化(DAB,×400)

圖3 各組大鼠腎組織中TGFβ1蛋白表達(dá)的變化(DAB,×400)

M：Marker，1～3：C組，DN+RAP組，DN組

圖4各組大鼠腎臟TGF-β1、FNmRNA表達(dá)

表3 各組大鼠腎小球TGF-β1、FN腎小球陽性指數(shù)及腎皮質(zhì)灰度的表達(dá)±s，n=8)

3 討 論

腎小球肥大及基底膜增厚是早期DN病的主要表現(xiàn)，本糖尿病早期腎臟肥大常有短暫的細(xì)胞增殖，隨后是較長(zhǎng)時(shí)間的腎臟細(xì)胞的體積增大和代謝亢進(jìn)〔3〕。磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)又稱為蛋白激酶B(PKB)位于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的上游。PI3-K/AKT/mTOR通路的調(diào)控失常在糖尿病狀態(tài)下腎臟肥大中發(fā)揮了一定的作用。營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子信號(hào)激活PI3-K，進(jìn)而導(dǎo)致AKT活化，AKT活化直接激活mTOR，mTOR通過磷酸化其下游的兩個(gè)效應(yīng)因子P70S6K及4EBP-1，從而啟動(dòng)翻譯過程，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成〔4〕。大量蛋白質(zhì)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的堆積，造成蛋白質(zhì)/DNA比例失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞肥大。Nagai等〔5〕研究高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞肥大的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞中AKT及mTOR是被激活的。雷帕霉素進(jìn)入細(xì)胞后，與其胞質(zhì)受體FK-506結(jié)合蛋白-12相結(jié)合形成藥物-受體復(fù)合物，能與mTOR相互作用，抑制P70S6K的活化和4EBP-1的磷酸化，從而抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成。本研究提示抑制糖尿病大鼠腎小球細(xì)胞肥大、改善腎功能，可能是其延緩DN病進(jìn)展的機(jī)制之一。

TGF-β1可通過促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，阻止細(xì)胞從G1期過渡到S期，從而抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)其肥大〔6〕。TGF-β1還能通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原、FN和laminin的合成來增加ECM聚集。ECM的各種成分中以FN的反應(yīng)最為迅速和持久，先于膠原Ⅳ、膠原Ⅴ和層黏蛋白，其持續(xù)增加促進(jìn)腎臟纖維化進(jìn)展。Goc等〔7〕的研究顯示，TGF-β能通過活化AKT /mTOR及其下游的P70S6K和4EBP-1通路，進(jìn)而刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包括FN的合成，而mTOR抑制劑雷帕霉素可在翻譯水平阻斷TGF-β對(duì)FN等系膜基質(zhì)的刺激合成。本研究結(jié)果提示，雷帕霉素能夠通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而抑制FN等系膜基質(zhì)聚集，從而達(dá)到延緩DN病進(jìn)展的目的。

4 參考文獻(xiàn)

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