羥基磷灰石納米管于大鼠股骨肌袋異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究

王曉波，陳一心，鄭欣，郭向可，王駿飛，李東亞，邱旭升，施鴻飛，王楊雨凡

(1.東南大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 骨科，江蘇 南京 210008； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210008； 3.南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 210008；4.徐州市中心醫(yī)院 骨科，江蘇 徐州 221000)

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是脊椎動(dòng)物骨骼的主要成分，人體骨中HAP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占95%以上。人工合成的HAP具有良好的生物相容性、生物活性和骨傳導(dǎo)作用，是一種優(yōu)良的骨組織替代材料[4]。我們前期研究中利用有機(jī)胺模擬天然HAP的生物生成過(guò)程，成功合成六邊形管狀結(jié)構(gòu)的單晶體HAP納米管[5]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HAP納米管具有很強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力，為其作為骨修復(fù)材料提供了依據(jù)。本研究采用大鼠股骨肌袋內(nèi)植入HAP納米管的方法，驗(yàn)證其在生物體內(nèi)的骨誘導(dǎo)能力，為考證HAP納米管的臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 HAP納米管的制備

采用Guo等[5]的方法，水熱法合成HAP納米管，可分成兩個(gè)部分：將有機(jī)胺溶液緩慢滴入Ca(H2PO4)2和CaCl2混合溶液中；6 h行水熱法處理并調(diào)節(jié)溶液pH為8.2，得HAP納米管。透射電鏡(TEM)進(jìn)行材料晶粒形貌和尺寸觀察分析(圖1)，其橫切面為六邊形，管兩端開(kāi)放結(jié)構(gòu)的HAP納米管，納米管的內(nèi)徑和外徑分別為8～50 nm和20～80 nm。

圖1納米管的示意圖及電子顯微鏡圖片a.HAP納米管的示意圖，為圖片清晰，氧原子已經(jīng)移除；b.顯示HAP納米管為橫切面正六邊形、兩端開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)徑和外徑分別為8～50 nm和20～80 nm

Fig1TheschematicdiagramandSEMofHAPnanotubes

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

10只雄性大鼠，3月齡，平均體重200 g，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，已排除先天性畸形、營(yíng)養(yǎng)不良等疾病。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位，股部皮膚消毒后切開(kāi)皮膚，暴露股筋膜，鈍性分離骨外側(cè)肌形成肌袋，將HAP納米管粉末約2 g植入右側(cè)肌袋，暴露左側(cè)肌袋不植入材料作為對(duì)照。依次縫合肌筋膜和皮膚，碘伏消毒切口。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素40萬(wàn)U。正常喂養(yǎng)。

1.3 大體、影像學(xué)觀察

記錄實(shí)驗(yàn)大鼠的進(jìn)食、活動(dòng)等一般情況以及切口有無(wú)紅腫、滲出等表現(xiàn)。術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后4、8、12周行X線及CT掃描檢查，觀察有無(wú)骨形成、植入?yún)^(qū)密度影的變化等。

1.4 組織學(xué)觀察

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

所有大鼠切口愈合良好，無(wú)明顯感染表現(xiàn)。1周時(shí)植入?yún)^(qū)有明顯淤血腫脹表現(xiàn)；12周時(shí)，切開(kāi)植入?yún)^(qū)可見(jiàn)組織為硬結(jié)節(jié)狀，邊緣不規(guī)則，周?chē)∪饨M織顏色與正常相差不大，取組織時(shí)明顯可見(jiàn)組織包裹的HAP納米管粉末。

2.2 X線及CT三維成像觀察

術(shù)后各期X線及CT掃描均未見(jiàn)植入?yún)^(qū)與骨組織密度相當(dāng)?shù)母呙芏扔?；各期均可?jiàn)未被吸收的HAP納米管材料(圖2)。

圖2大鼠術(shù)后及第8周CT掃描三維重建圖和X線攝片a.術(shù)后當(dāng)天的CT掃描三維重建圖，植入?yún)^(qū)可見(jiàn)分散的比骨組織密度低的HAP納米管粉末；b.植入物第8周的CT掃描三維重建圖，植入?yún)^(qū)未見(jiàn)明顯高密度影，可見(jiàn)植入側(cè)HAP納米管粉末聚集；c.植入物第8周X線圖，可見(jiàn)植入?yún)^(qū)有高密度影

2.3 組織學(xué)觀察

處死后植入?yún)^(qū)外圍可見(jiàn)明顯的肌細(xì)胞，肌袋內(nèi)可見(jiàn)大量的植入物成簇排列，并被淋巴細(xì)胞包繞，形成類(lèi)似巢狀結(jié)構(gòu)。植入物周?chē)匆?jiàn)軟骨細(xì)胞成骨、毛細(xì)血管生成及HAP納米管粉末降解(圖3)。

3 討 論

HAP具有較好的生物相容性和生物活性，同時(shí)對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性和致癌性，能夠滿足植入替代骨材料的基本要求。HAP的骨傳導(dǎo)性能已被普遍認(rèn)可，但生物陶瓷載體的性能受原料、制備工藝的影響較大，其在骨骼肌異位成骨中以材料表面新骨沉積為主[6]，因此，若需要利用其修復(fù)負(fù)重部位骨缺損，則必須使材料達(dá)到可進(jìn)行良好骨替代的要求，從納米結(jié)構(gòu)上重建材料的晶體微徑，可以使HAP獲得更優(yōu)良的生物性能，有望有效替代新生骨組織[7]。它兼具HAP的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)能力，同時(shí)，納米級(jí)HAP在功能上表現(xiàn)出一些特異性能，如更好的生物相容性、生物活性、生物力學(xué)行為和降解吸收等性能[8]。

圖3植入?yún)^(qū)HE染色病理圖可見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)，淋巴細(xì)胞包繞材料形成類(lèi)似巢狀結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯骨組織

Fig3HEstainingpathologicalpictureofimplantedarea

前期研究中合成的HAP納米管材料的直徑為20～80 nm、長(zhǎng)1～20 μm，具有比HAP納米棒更大的比表面積，可以提高HAP材料的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)能力。HAP納米管生物力學(xué)性能不佳，不能單獨(dú)制作大型植入物固定材料，但其穩(wěn)定性強(qiáng)，不易被吸收，可用于制作用于骨折固定植入物的表面涂層，使植入物不僅可以防止被腐蝕，同時(shí)在納米管中填充抗生素等能夠作為感染性骨缺損良好的植入材料，提高植入材料的骨誘導(dǎo)和抗感染能力。

導(dǎo)致本研究中實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性的原因可能有：(1) 本實(shí)驗(yàn)中并未將HAP納米管材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)后植入大鼠體內(nèi)，只是將HAP納米管粉末置于大鼠股骨肌袋，可能由于肌袋內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)少或者納米管捕獲能力較差，導(dǎo)致植入?yún)^(qū)并未捕獲到干細(xì)胞而導(dǎo)致無(wú)法分化成骨；(2) 實(shí)驗(yàn)使用的是未經(jīng)修飾的HAP納米管粉末，在動(dòng)物體內(nèi)的分散性差，可能導(dǎo)致聚集現(xiàn)象而使HAP納米管成團(tuán)成簇排列，其比表面積反而變小，致使骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力變??；(3) 可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)，不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)材料的驗(yàn)證有區(qū)別。Yang等[12]將合成的一種生物陶瓷分別植入狗、豬、羊、兔和鼠的肌肉內(nèi)和皮下組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌肉內(nèi)植入45 d和皮下植入60 d的狗和豬的一些樣品內(nèi)有明顯的骨形成，而植入羊、兔和鼠的肌肉或皮下的任何樣本內(nèi)直到120 d均無(wú)新骨形成。同樣的，Ripamonti[13]發(fā)現(xiàn)，HAP在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(狒狒)體內(nèi)的成骨能力明顯高于其在其他動(dòng)物如狗、兔等動(dòng)物體內(nèi)的成骨能力。本實(shí)驗(yàn)采用的是SD大鼠，可能HAP納米管對(duì)其骨誘導(dǎo)性較差。

HAP納米管可用于制作骨組織工程支架材料，其與成骨細(xì)胞具有較好的生物相容性，可以促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖和代謝。后續(xù)研究中可將HAP納米管與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后制成具有力學(xué)結(jié)構(gòu)的生物支架，進(jìn)行大動(dòng)物體內(nèi)等的異位成骨能力研究，來(lái)進(jìn)一步證實(shí)HAP納米管的生物特性。