16S rRNA基因序列分析在人體微生物組學(xué)研究中的進展及應(yīng)用

田芳云 黃婷婷 黃光武 張 哲

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,廣西 南寧 530021)

在人體表面以及與外界相通的腔道中，如皮膚、胃腸道、鼻腔等部位，定植著大量以細菌為主的微生物群落。這些微生物的數(shù)量可達人體自身細胞數(shù)的10倍以上，其基因數(shù)量更多達人體基因數(shù)的100多倍〔1〕。微生物群落在人體內(nèi)維持一定的動態(tài)平衡，參與調(diào)節(jié)人體的一系列生理生化反應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)、食物消化、維生素合成等。因此，微生物群落的平衡失調(diào)可能導(dǎo)致各種感染性、過敏性疾病甚至腫瘤的發(fā)生。人體微生物組的概念最早在2001年提出，是對人體共棲、共生和致病的所有微生物的總稱。微生物基因組是人體基因組中不可缺少的組成部分，人體微生物組測序也被認為是"人體第二個基因組計劃"〔2〕。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是DNA測序技術(shù)的進步，人們對人體微生物組的研究更加深入，使得微生物組在人體健康與疾病中扮演的角色越來越受到重視。

1 人體微生物組的研究

2007年，美國國立衛(wèi)生院(NIH)正式宣布啟動人體微生物組計劃(Human Microbiome Project, HMP)，其主要包括：(1)對正常人體不同部位的微生物群落進行高通量測序研究，全面了解人體微生物群落的特點；(2)分析微生物群落的改變是否和人體健康或疾病相關(guān)；(3)建立標準化的微生物樣本采集方法、分析程序、微生物數(shù)據(jù)庫，為其他相關(guān)科研提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支持〔2〕。HMP第一階段研究成果已于2012年相繼公布在Nature和PLoS等雜志上，研究者分析了242個健康人的4 788份樣本，通過16S rRNA基因測序分析得到5 177份微生物分類單元，其分類覆蓋了人體微生物屬的81%～99%；并通過鳥槍法全基因組測序分析得到近800個菌種的基因組序列。研究還發(fā)現(xiàn)個體之間微生物群落各有特點，沒有任何一種細菌普遍存在于所有人體的所有部位，人體不同部位都至少有一種占主導(dǎo)地位的優(yōu)勢菌群〔3～5〕。HMP第二階段的研究仍在進行中，其將具體分析微生物菌落在人體疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

2 微生物組學(xué)研究的方法

人們對微生物組的認識在很大程度上取決于研究手段。傳統(tǒng)的鑒定手段主要基于微生物的培養(yǎng)方法，目前主要應(yīng)用于微生物生長、代謝等功能研究以及對抗生素敏感性和致病性的評價。但此法耗時長、特異性差，且?guī)缀?9%的微生物不可在實驗室環(huán)境下培養(yǎng)〔6〕，這極大限制了人們對微生物的研究。1998年Handelsman等〔7〕提出了宏基因組學(xué)的概念，旨在對環(huán)境中全部微生物基因組進行研究，從而了解它們的種群結(jié)構(gòu)、多樣性、功能活性、相互關(guān)系及對環(huán)境的影響等。宏基因組學(xué)研究包括了可培養(yǎng)、非可培養(yǎng)的微生物，對特定環(huán)境微生物菌群的研究更全面更具體；其研究策略主要有16S rRNA基因測序分析和全基因組測序分析〔8,9〕(16S rRNA基因測序與全基因組測序的對比見表1)。

2.116S rRNA基因測序 16S rRNA基因測序主要用于菌群構(gòu)成和物種多樣性等分析。16S rRNA基因是核糖體30S亞基的組成部分，其長度適中，約為1 500 bp，存在于所有的細菌、衣原體、立克次體、支原體、螺旋體及放線菌等原核生物中，但不存在于病毒或真菌等非原核生物內(nèi)。16S rRNA基因由交錯排列的可變區(qū)和保守區(qū)組成，保守區(qū)為所有細菌所共有，可變區(qū)在不同細菌之間存在不同程度的差異，具有屬或種的特異性。通過對可變區(qū)或全長序列的分析及同源性比較，可以計算不同菌屬和菌種在遺傳進化的距離〔10〕。近年來隨著測序技術(shù)發(fā)展，特別是第二代高通量測序技術(shù)的成熟，16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫得到了極大豐富。到2013年10月為止，Ribosomal Database Project (RDP)數(shù)據(jù)庫記錄了280 940 6條細菌和古生菌的16S rRNA基因序列，并做了注解和歸類〔11〕，這為16S rRNA基因測序用于微生物的鑒定提供了有力的數(shù)據(jù)支持。

2.2全基因組測序 全基因組測序通過對環(huán)境中全部微生物的全組DNA進行測序分析，不但能了解微生物群體的多樣性及豐度，還能發(fā)掘和研究具有特定功能的新基因，鑒別某些以16S rRNA基因測序難以鑒別的微生物種類〔1,12〕。但也存在如下問題：由于目前DNA提取方法的限制，無法取得所有微生物全部的DNA序列，提取過程中易受外界DNA干擾；缺乏合理有效的質(zhì)量控制，操作繁瑣，人力物力耗費大；序列信息分析復(fù)雜等〔13〕(見表1)。

表1 16S rRNA基因測序與全基因組測序方法的比較

3 16S rRNA基因序列分析在人體疾病中的研究

3.1腸道菌群失衡與疾病 人體腸道內(nèi)的細菌數(shù)約有1 014個〔14〕，人們通過16S rRNA基因測序分析發(fā)現(xiàn)肥胖、代謝綜合征、Ⅱ型糖尿病以及腸道炎癥等與腸道細菌結(jié)構(gòu)和數(shù)量失衡密切相關(guān)。Walker等〔15〕通過對多名克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎患者及健康對照的腸道標本分析發(fā)現(xiàn)，炎性腸疾病者的菌群多樣性明顯減少，菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，其中厚壁菌明顯減少而擬桿菌增加。Larsen等〔16〕發(fā)現(xiàn)Ⅱ型糖尿病患者腸道中厚壁菌數(shù)量明顯減少，而擬桿菌、變形菌門比例升高，且擬桿菌和厚壁菌的比值與糖耐量下降密切相關(guān)。2011年一項對卡路里攝入及糞便菌群的研究發(fā)現(xiàn)，飲食能在短時間內(nèi)引起腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響腸道營養(yǎng)及能量的吸收，如高能量的飲食則會引起腸道厚壁菌門數(shù)量增多，增加腸道能量吸收，同時減少糞便中卡路里含量〔17〕。這些研究不僅科學(xué)地詮釋了人體健康與腸道菌群的微妙關(guān)系，還有助于預(yù)防和干預(yù)由腸道菌群失衡引發(fā)的肥胖、腸炎和糖尿病等疾病。

3.2陰道菌群失衡與疾病 目前通過16S rRNA基因測序已鑒定出約20種存在于女性陰道內(nèi)的乳酸桿菌。大部分健康(正常)婦女陰道菌群以卷曲乳酸桿菌、惰性乳桿菌、加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌中的1～2種為主，且數(shù)量占到95%的絕對優(yōu)勢〔18,19〕。乳酸桿菌產(chǎn)生的過氧化氫、乳酸及細菌素對于維持陰道微環(huán)境穩(wěn)定十分重要，因此其數(shù)量改變可引起常見陰道炎癥性疾病，Liu等〔20〕通過對比健康婦女、細菌性陰道炎(BV)患者、陰道念珠菌病(VVC)患者、合并VVC和BV患者的陰道分泌物發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬含量最低但菌群種類最多的是BV患者，其次為合并有VVC與BV的患者。王克迪等〔21〕的研究表明，BV患者陰道菌群表現(xiàn)為乳酸桿菌顯著減少甚至缺失，而其他的雜菌如加德納菌、普雷沃氏菌屬等占優(yōu)勢，并有厭氧菌共存。

3.3口腔菌群失衡與疾病 2008年人體口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(HOMD)正式啟動，該數(shù)據(jù)庫主要建立在16S rRNA基因序列分析的基礎(chǔ)上，記錄了13門 619種口腔微生物分類。Dewhirst等〔22〕進一步研究了正?？谇痪褐?6 043個16S rRNA基因克隆，鑒定出1 179種細菌分類，其中68%此前未被培養(yǎng)，經(jīng)鑒定將有434個新的細菌種屬增加到HOMD中。Yang等〔23〕結(jié)合16S rRNA基因和全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)齲病患者和無齲者微生物群落構(gòu)成明顯不同，無齲病個體微生物組較單一，而齲病患者微生物構(gòu)成復(fù)雜多樣，其中有147個細菌操作分類單位(OTUs)與齲齒有關(guān)，可作為評估齲病風(fēng)險和預(yù)后的指標〔23〕。

3.4皮膚菌群失衡與疾病 2009年Grice等〔24〕鑒定出19個門205個屬的細菌，根據(jù)與人體的關(guān)系分為以葡萄球菌、丙酸菌等為主的共生菌，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等為主的致病菌，該研究成果發(fā)表在Science雜志上。人類很多皮膚疾病都與菌群結(jié)構(gòu)和豐度改變有關(guān)?；?6S rRNA基因的非培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡患者的毛囊內(nèi)除了常見的丙酸菌外還鑒定出少量此前未被培養(yǎng)出的放線菌、顆粒丙酸菌、普氏厭氧球菌等，但健康者的毛囊中細菌相對單一〔25,26〕。Statnikov等〔27〕發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損部位、銀屑病外觀正常皮膚、正常皮膚之間的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，這為區(qū)分這三種皮膚提供重要的理論依據(jù)并指導(dǎo)針對性治療。

3.5鼻咽部菌群失衡與疾病 鼻咽部菌群的改變可引起急性中耳炎、鼻竇炎、口腔炎、上呼吸道感染甚至肺炎等〔28,29〕，Hilty等〔30〕發(fā)現(xiàn)58個細菌科，其中以莫拉菌科、鏈球菌科、巴斯德氏菌科最為常見，中耳炎患者鼻咽部共生菌群相對健康者明顯減少，而肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等致病菌明顯增加。另一項研究發(fā)現(xiàn)兒童鼻咽部菌群在秋冬季存在明顯差異，且這種差異性不受抗生素、性別、年齡的影響，因此推測鼻咽部菌群的改變可能是兒童在秋冬季好發(fā)呼吸道感染性疾病的病因〔31〕。對鼻咽部菌群的分析，將為對某些上呼吸道疾病、中耳炎等的病原分析方面提供依據(jù)，從而指導(dǎo)治療。

4 基于16S rRNA基因的非培養(yǎng)技術(shù)在人體微生物組學(xué)研究和應(yīng)用的展望

共生微生物與人體保持著動態(tài)平衡，這對維護機體健康起著十分重要的作用。人體各部位細菌結(jié)構(gòu)存在明顯差異，即使在同一部位也存在著一定的個體差異，因此對人體微生物進行鑒定并對它們的生理功能進行解析，建立人體微生物組數(shù)據(jù)庫，可為疾病的病因分析及預(yù)防、治療等方面提供新思路新方法。基于16S rRNA基因的非培養(yǎng)技術(shù)是一種快速、敏感特異性高的微生物鑒定方法，第二代測序技術(shù)的飛速發(fā)展使16S rRNA基因高通量測序成為可能，并讓微生物組學(xué)研究尤其是微生物鑒定、多樣性分析以及相關(guān)的應(yīng)用更為廣泛和準確。這些研究手段和成果可以進一步揭示人體微生物組學(xué)在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演的角色，并最終應(yīng)用于臨床疾病的診斷和指導(dǎo)治療。

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