不同負(fù)荷規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制

王桂華 欒海云 馬春蕾 施 真 于臘梅

(濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 煙臺(tái) 264003)

膽堿能系統(tǒng)在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶功能中發(fā)揮重要作用，其功能減退可導(dǎo)致記憶力下降。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)動(dòng)物海馬的神經(jīng)發(fā)生水平，增加突觸數(shù)量，加快長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的形成，從而提高動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力〔1〕。本實(shí)驗(yàn)觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能及大腦皮層和海馬組織乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響，探討運(yùn)動(dòng)能否預(yù)防或減輕衰老引起的記憶功能減退及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所)、曠場實(shí)驗(yàn)箱(自制)，AchE試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠50只，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(魯)20090001〕。飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，溫度20℃±3℃，每天12 h光照，12 h黑暗，自由飲食，將其分為青年對(duì)照組(3月齡)、老年對(duì)照組(16月齡)、老年運(yùn)動(dòng)組(16月齡)：15 min/d游泳組、30 min/d游泳組、力竭游泳組，每組10只。運(yùn)動(dòng)條件〔2，3〕為80 cm×60 cm×40 cm立方形水體，水溫(25±1)℃，大鼠在水箱中游泳，四壁光滑且高出水面20 cm，無法借力及躍出。每次運(yùn)動(dòng)后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風(fēng)吹干后，放回籠中休息。力竭游泳組，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)組每天1次力竭游泳運(yùn)動(dòng)，大鼠尾部負(fù)重體重的3%，每天1次，每周5 d，休息2 d，連續(xù)12 w，每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間不少于2 h，力竭標(biāo)準(zhǔn)，即大鼠連續(xù)沉入水中超過10 s，撈出后置于平面不能完成翻正反射。對(duì)照組動(dòng)物安靜飼養(yǎng)12 w。

1.2.2曠場實(shí)驗(yàn) 游泳運(yùn)動(dòng)12 w后，休息24 h后進(jìn)行開場實(shí)驗(yàn)。敞箱高40 cm，長、寬為80 cm，四壁及底面為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25塊。每只動(dòng)物測定1次，每次測定5 min。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內(nèi)，以穿越底面的格數(shù)記錄為水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)，測量大鼠的活動(dòng)度，以后肢直立次數(shù)記錄為垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)，測量大鼠對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暗光、安靜，箱底打掃清凈、干燥。

1.2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 曠場實(shí)驗(yàn)后8 h，進(jìn)行水迷宮檢測，水池直徑為100 cm，高60 cm，水深42 cm，水溫(25±1)℃，站臺(tái)高度為40 cm，站臺(tái)頂端平面10 cm×10 cm，平臺(tái)沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。訓(xùn)練4 d，第5天進(jìn)行隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)，分析處理潛伏期，考察學(xué)習(xí)能力。第6天撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，去除平臺(tái)并觀察2 min內(nèi)大鼠在中心區(qū)停留時(shí)間百分比和通過原平臺(tái)位置次數(shù)，測試記憶能力。

1.2.4AchE活性檢測 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后斷頭處死大鼠，冰上迅速分離全腦，分別取皮層和海馬，稱重后用相當(dāng)于組織質(zhì)量9倍的生理鹽水分別將皮層和海馬制成勻漿，4℃ 3 500 r/min(離心機(jī)半徑為16 cm)離心10 min，去上清液，進(jìn)行AChE活性檢測，方法按照說明書進(jìn)行。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

2 結(jié) 果

2.1曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1。運(yùn)動(dòng)前各組(除青年對(duì)照組外)大鼠水平、垂直活動(dòng)數(shù)無明顯差異(P>0.05)。青年對(duì)照組和老年對(duì)照組大鼠12 w后水平、垂直活動(dòng)較之前均有所減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)并無顯著差異(P>0.05)，提示隨著月齡增加，大鼠活動(dòng)逐漸減少。游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練12 w后，15、30 min/d游泳運(yùn)動(dòng)組大鼠水平、垂直活動(dòng)與老年對(duì)照組大鼠相比，明顯增高(P<0.05或P<0.01)，而力竭游泳組大鼠水平、垂直活動(dòng)數(shù)較老年對(duì)照組大鼠有所降低，但兩者組間比較無顯著性差異(P>0.05)，提示15、30 min/d游泳運(yùn)動(dòng)使老年大鼠活動(dòng)增多，而力竭游泳運(yùn)動(dòng)使老年大鼠活動(dòng)數(shù)和探究能力有所下降。

2.2水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)中，與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組逃避潛伏期增加(P<0.01)；15 min/d游泳和力竭游泳組潛伏期較老年對(duì)照組縮短，但無顯著差異(P>0.05)，而30 min/d游泳組逃避潛伏期較老年對(duì)照組明顯縮短(P<0.01)?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)中，與青年對(duì)照組比較， 老年對(duì)照組大鼠在中心區(qū)停留時(shí)間百分比和通過原平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少(P<0.01) 。與老年對(duì)照組相比，游泳運(yùn)動(dòng)各組中心區(qū)停留時(shí)間百分比和通過原平臺(tái)位置次數(shù)均有不同程度增加，尤以30 min/d游泳組增加明顯(P<0.05或P<0.01)，見表2。

2.3大腦皮層和海馬AchE活性及表達(dá) 與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組大鼠大腦皮層和海馬AchE活性均明顯升高(P<0.01)；游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，老年大鼠皮層和海馬AchE活性均不同程度降低，以30 min/d游泳運(yùn)動(dòng)作用最為明顯(P<0.01)。見表3。

表1 大鼠曠場實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分

表2 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)隱蔽平臺(tái)搜索、空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 各組大鼠大腦皮層和海馬組織AchE活性

3 討 論

腦易受衰老影響，腦衰老表現(xiàn)為認(rèn)知功能低下和中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降。Singh等〔4〕發(fā)現(xiàn)16月齡大鼠學(xué)習(xí)記憶功能降低，故本實(shí)驗(yàn)選用16月齡大鼠作為研究對(duì)象，觀察不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)其干預(yù)作用。Morris水迷宮主要用于測試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶儲(chǔ)存的機(jī)制主要涉及邊緣系統(tǒng)(如海馬)以及大腦皮層相關(guān)腦區(qū)。水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，老年大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯低于青年大鼠，說明老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能降低；中、小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可有效提高老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。為排除衰老合并抑郁癥， 我們引入了抑郁癥動(dòng)物模型的經(jīng)典篩選方法開場實(shí)驗(yàn)排除了抑郁癥所致的思維遲鈍、行動(dòng)遲緩、情緒低落對(duì)Morris水迷宮測試結(jié)果的影響，使行為學(xué)結(jié)果更具可靠性和科學(xué)性。

神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說認(rèn)為：參與或影響學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)遞質(zhì)是多系統(tǒng)的，但大腦記憶功能強(qiáng)弱主要取決于大腦內(nèi)乙酰膽堿(Ach)水平。當(dāng)大腦內(nèi)Ach水平高時(shí)，記憶腦區(qū)神經(jīng)傳導(dǎo)功能就會(huì)增強(qiáng)，腦神經(jīng)之間信息傳遞速度加快，記憶能力增強(qiáng)〔5〕。膽堿酯酶可水解乙酰膽堿，生成乙酸和膽堿，終止神經(jīng)沖動(dòng)傳遞，間接反映乙酰膽堿代謝。有研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠膽堿酯酶活性下降與記憶功能降低呈平行關(guān)系〔6〕，其活力直接反映該系統(tǒng)的功能狀態(tài)，因此，Ach水平的變化可通過其水解酶AchE的活性反映。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示老年大鼠大腦皮層和海馬AchE活性增高導(dǎo)致Ach水平下降可造成空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，從不運(yùn)動(dòng)的老人通過步行運(yùn)動(dòng)，其思維能力如計(jì)劃、安排和工作記憶力都相對(duì)有所改善〔7，8〕。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，運(yùn)動(dòng)有助于動(dòng)物海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元的增殖、存活和分化，促進(jìn)LTP的誘導(dǎo)，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間記憶和被動(dòng)逃避記憶能力〔9，10〕。運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠認(rèn)知和記憶功能的保護(hù)作用與運(yùn)動(dòng)的負(fù)荷有很大的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老年組大鼠較青年組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力功能明顯下降，適當(dāng)負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以提高老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，中負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)效果最好；其次是小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，相對(duì)比較大負(fù)荷(力竭游泳)運(yùn)動(dòng)對(duì)老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力未見明顯提高，同時(shí)開場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示力竭游泳組老年大鼠表現(xiàn)一定程度的抑郁狀態(tài)。為進(jìn)一步探索運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善機(jī)制，通過檢測大腦皮層和海馬膽堿酯酶活力以期證明適量運(yùn)動(dòng)改善了腦組織Ach的水平，從而達(dá)到了改善老年大鼠對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶的影響。結(jié)果顯示，數(shù)天的不同負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)能降低大腦皮層和海馬組織膽堿酯酶活力，以小和中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)作用效果明顯，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)效果并不理想， 可能大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)使老年大鼠極度疲勞，處于應(yīng)激狀態(tài)，大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放紊亂，影響情緒和認(rèn)知功能，而起不到改善認(rèn)知功能作用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)踐中制定對(duì)老個(gè)體進(jìn)行運(yùn)動(dòng)治療的方案時(shí)，要針對(duì)不同的個(gè)人情況選擇個(gè)性化運(yùn)動(dòng)方案，只有適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)才可以獲得最好的效果。

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