依達(dá)拉奉對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮層細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

楊東娜 白 洋 王 策

(沈陽(yáng)市第五人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110023)

腦血管病具有發(fā)病率高、致殘率高的特點(diǎn)，其中缺血性腦血管病約占腦血管病的80%。腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，壞死區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞由于完全性缺血發(fā)生不可逆的死亡，而缺血半暗帶區(qū)仍有可存活的神經(jīng)元，通過細(xì)胞凋亡形式損傷，這部分神經(jīng)元的損傷是可逆性的，通過影響細(xì)胞凋亡而保護(hù)這部分神經(jīng)元是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠135只，體重240～280 g，3～4月齡，由長(zhǎng)春市高新開發(fā)區(qū)動(dòng)物中心提供。合格號(hào)為(吉)2010-2011。

1.2藥物和試劑 10%水合氯醛(吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科生產(chǎn))，氯化紅四氮唑(TTC，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司生產(chǎn))，Caspase-3 mRNA原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，抗體用兔抗大鼠Caspase-3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛(北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)的粉末自己配制)TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色液(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)室提供)，圖像分析儀(HMIAS-2000醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng))，生物顯微鏡(OLYMPUS CX31)。依達(dá)拉奉注射液：昆明積大制藥有限公司。

1.3動(dòng)物模型制備 采用改良的Zea Longa線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。大鼠術(shù)前禁食12 h,不禁水，10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g體重給予大鼠腹腔注射麻醉后取仰臥位固定，常規(guī)備皮消毒，待大鼠的全身肌肉松弛后開始手術(shù)，采用直徑為0.234 mm的斷端打磨光滑的尼龍魚線。手術(shù)全程盡量保證無菌操作，術(shù)后用慶大霉素注射液沖洗手術(shù)創(chuàng)口后逐層縫合，栓線尾端外露部分標(biāo)記，術(shù)后大鼠放置在烤燈下保溫，保證術(shù)后肛溫36.5～37.5℃，增加大鼠的術(shù)后存活率。術(shù)后的大鼠進(jìn)行Longa等〔1〕神經(jīng)缺損功能評(píng)分:0分：無神經(jīng)系統(tǒng)損傷體征；1分：不能完全伸展右側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：站立不穩(wěn)，向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。功能評(píng)分1～3分為模型成功，如實(shí)驗(yàn)有死亡的鼠，取同批次的鼠補(bǔ)足。在缺血后2 h小心外拉栓線約1 cm使其斷端回至CCA內(nèi)，形成再灌注。假手術(shù)組將尼龍線僅留在頸內(nèi)動(dòng)脈而不入顱，2 h后，將尼龍線拉回至頸外動(dòng)脈處。依達(dá)拉奉組在再灌注后1、1.5 h在腹腔內(nèi)注射依達(dá)拉奉注射液(按照3 mg/kg)2次。每組各45只。分別于再灌注后6、12、48 h處死大鼠。術(shù)后假手術(shù)組和模型組大鼠各分成3組，分別檢測(cè)腦梗死體積、缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況和缺血區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)。

1.4梗死體積測(cè)定 各組大鼠分別在再灌注后6、12、48 h時(shí)間點(diǎn)斷頭處死，3 min內(nèi)取腦，把腦取出后去掉小腦、低位腦干和前部嗅球，保留大腦半球，從前到后每隔2 mm切為厚薄均勻的5～6片。置于2%TTC中37℃水浴30 min左右?？梢娬ＤX組織著色為深粉紅色，梗死部分不著色為白色。用數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī)，用圖像分析軟件計(jì)算梗死面積。

1.5檢測(cè)缺血區(qū)TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 各組大鼠分別在再灌注6、12、48 h麻醉，打開胸腔，完全暴露心臟，由左心室插入20號(hào)針頭，剪開右心耳，生理鹽水灌注后見大鼠四肢、眼睛、口唇黏膜逐漸變?yōu)榘咨倚亩鞒龀吻逡后w后繼續(xù)用4%多聚甲醛250 ml灌注固定，可見灌注過程中大鼠的四肢及頭尾逐漸僵硬。5 min內(nèi)取腦，去掉小腦、低位腦干和前部嗅球后放入新鮮配置的4%多聚甲醛中固定至少24 h。固定后的腦從前到后每隔2 mm切5～6片，取中間一片常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。包埋后組織塊連續(xù)冠狀切片，片厚約7 μm，買個(gè)鼠腦取2張切片TUNEL法檢測(cè)凋亡。

1.6缺血再灌注后Caspase-3表達(dá) 各組大鼠制備模型及取材同TUNEL檢測(cè)神經(jīng)凋亡細(xì)胞組，石蠟切片常規(guī)脫蠟后嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。胞漿被染成棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。應(yīng)用MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定額頂葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞胞漿的灰度值，染色越深，其值越小，反映胞質(zhì)內(nèi)蛋白表達(dá)越高，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野檢測(cè)灰度值和計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，取其平均值代表每只大鼠的陽(yáng)性表達(dá)程度。

2 結(jié) 果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦梗死體積 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠未見腦梗死發(fā)生。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積均有明顯增高(P<0.05)，模型組隨梗死時(shí)間的延長(zhǎng)，梗死體積也隨之增加(P<0.05)，使用依達(dá)拉奉治療后，各時(shí)間點(diǎn)梗死體積均明顯減小(P<0.05)。見表1。

2.2不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠僅見微量神經(jīng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)，且在再灌注12 h后神經(jīng)細(xì)胞凋亡最明顯(P<0.05)，使用依達(dá)拉奉治療后，各時(shí)間點(diǎn)梗死體積均明顯減小(P<0.05)。見表2。

2.3不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織Caspase-3表達(dá) 與假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)比較，模型組大鼠腦組織Caspase-3表達(dá)明顯增多(P<0.05)，使用依達(dá)拉奉治療后，各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織Caspase-3表達(dá)明顯下降(P<0.05)。見表3。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

表3 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織Caspase-3表達(dá)

3 討 論

目前認(rèn)為在梗死中心神經(jīng)細(xì)胞死亡的形式為壞死，而導(dǎo)致梗死半暗帶神經(jīng)細(xì)胞損傷的形式為細(xì)胞凋亡〔2〕。細(xì)胞發(fā)生凋亡還是死亡由多種因素決定，包括損傷程度、Ca2+超載程度、細(xì)胞內(nèi)ATP水平以及Caspase-3激活程度。凋亡細(xì)胞主要存在于缺血半暗帶，提示凋亡可能影響最后腦梗死的面積〔3〕。而在缺血再灌注后0.5 h可出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，24～48 h達(dá)到高峰，最長(zhǎng)可持續(xù)到28 d。凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而增多〔4～6〕。凋亡是各種凋亡刺激信號(hào)使動(dòng)，受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶類和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等調(diào)控的瀑布式級(jí)聯(lián)激活過程，其中蛋白酶與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。而凋亡的發(fā)生由Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程。Caspase家族在凋亡細(xì)胞的死亡中扮演了重要角色。Caspase-3酶原與CED-3蛋白有35%的一致性，58%的相似性，Caspase-3是Caspase家族中14個(gè)成員中，與凋亡關(guān)系最密切的，是Caspase級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素的凋亡程序中起最后樞紐作用。

隨著對(duì)腦缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制的研究，目前認(rèn)為腦缺血再灌注可引起腦內(nèi)一系列的生化改變，其中自由基過量蓄積是造成腦缺血再灌注后神經(jīng)組織損傷的重要環(huán)節(jié)，這已被廣泛認(rèn)可〔7〕。依達(dá)拉奉是目前唯一在臨床上使用的自由基清除劑，實(shí)驗(yàn)證明依達(dá)拉奉具有以下功能：清除缺血/再灌注后腦內(nèi)具有高度毒性的羥基集團(tuán)，一直腦缺血后梗死區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，一直脂質(zhì)過氧化，縮小梗死體積，抑制炎癥介質(zhì)白三烯的形成，減輕腦水腫，減少細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示隨著再灌注后時(shí)間的推移，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加，梗死體積增大，Caspase-3蛋白表達(dá)增多，提示神經(jīng)元凋亡數(shù)增加以及Caspase-3蛋白表達(dá)增加與梗死體積增大有明顯的相關(guān)性。

4 參考文獻(xiàn)

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7Sweeney ML.Neuroprotective effects of adenosine incerebral ischemia：window of opportunity〔J〕. Neurosci Biobehav Rev,2004;21(2):207.