不同年齡大鼠消化道Cajal細(xì)胞c-kit受體表達(dá)的變化及意義

李 永 王進(jìn)海 秦 燕 鄒百倉

(西安交通大學(xué)第二醫(yī)院消化科，陜西 西安 710004)

國內(nèi)外的一系列流行病學(xué)調(diào)查報告顯示在成年人中，功能性便秘具有較高的發(fā)病率，而在65歲以后的老齡人群中，其發(fā)病率更是顯著升高〔1～4〕。胃腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是消化道運動的起搏細(xì)胞，產(chǎn)生和傳播胃腸道慢波節(jié)律，形成胃腸道平滑肌的節(jié)律性收縮，對胃腸運動具有重要的作用。本研究擬探討生理性衰老過程中胃腸運動功能的變化及其在老年人功能性胃腸疾病發(fā)生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組 選用清潔I級不同年齡的雄性SD大鼠80只(成都天碩動物繁殖基地提供)按年齡分為3月齡組(青年組)、9月齡組(壯年組)、18月齡組(壯年組)、24月齡組以及30月齡(后兩組均為老齡組)5組，分別相當(dāng)于人的14、22.5、45、60和75歲，每組16只。將動物購買后在安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7 d。所有動物均給予普通飼料，自由飲水。

1.2取材 每組大鼠隨機(jī)選取8只處死后開腹截取胃體、空腸、回腸、結(jié)腸、乙狀結(jié)腸與直腸交界(簡稱交界)部位標(biāo)本，放入4%多聚甲醛液中過夜，20%蔗糖過夜脫水，液氮中放置1 min，然后放入-80℃冰箱備用。將冰凍標(biāo)本切片，片厚8 μm。

1.3免疫組化染色 嚴(yán)格按照免疫組化SABC染色法。0.01 mol/L檸檬酸鈉溶液修復(fù)抗原；0.5%Triton液處理30 min；3%過氧化氫室溫孵育30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；5%羊血清封閉20 min，加入兔抗鼠c-kit受體多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，37℃ 1 h后4℃冰箱過夜；加入生物素標(biāo)記羊抗兔二抗，37℃ 40 min ；加入(濃縮型SABC免疫組化染色試劑盒購自中國武漢博士德生物工程有限公司)，37℃ 40 min；DAB顯色(DAB顯色試劑盒購自中國武漢博士德生物工程有限公司)，部分復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察并拍照。陰性對照以PBS代替相應(yīng)一抗。

1.4圖像采集和分析 胃腸壁環(huán)、縱肌層出現(xiàn)細(xì)胞胞漿棕黃色為c-kit受體染色陽性反應(yīng)。每張切片選取5個高倍鏡視野(400倍)，應(yīng)用Image Pro Plus軟件進(jìn)行掃描分析，根據(jù)公式：陽性表達(dá)積分光密度=(陽性表達(dá)平均光密度-背景平均光密度)×陽性表達(dá)面積，計算陽性表達(dá)積分光密度，取其平均值。

1.5腸道推進(jìn)率檢測〔5〕每組大鼠隨機(jī)選取8只禁食24 h，按5 ml/kg比例用灌胃針將印度墨汁灌入大鼠胃，30 min后處死大鼠并立即開腹取全胃腸，量取幽門括約肌至墨汁最前端距離及全腸道長度，以兩者之比為腸道推進(jìn)率。

2 結(jié) 果

2.1c-kit受體陽性表達(dá) 如圖1、圖2所示，在大鼠的胃體、空場、回腸、結(jié)腸以及結(jié)腸與直腸交界5個部位c-kit受體陽性細(xì)胞的胞體較大，呈圓形、紡錘狀或不規(guī)則形，每個細(xì)胞均有數(shù)個不規(guī)則突起。在未HE染色的條件下，c-kit受體陽性細(xì)胞呈團(tuán)簇狀連續(xù)或間斷的分布于大鼠消化道的肌層，主要分布于環(huán)、縱肌層之間，與環(huán)肌層平滑肌平行。與3月齡組、9月齡組和18月齡組大鼠相比，老年大鼠(24月齡和30月齡)肌間ICC c-kit受體表達(dá)顯著下調(diào)，其中以乙狀結(jié)腸與直腸交界處變化最為顯著(P<0.05)，見表1。

2.2腸道推進(jìn)率 大鼠腸道推進(jìn)率從3月齡的(67.2±13.5)%逐漸減少到30月齡的(52.1±9.8)%(P<0.01)。與3月齡、9月齡(65.7±14.2)%及18月齡(62.9±12.3)%大鼠比較，24月齡(57.2±10.7)%和30月齡大鼠腸道推進(jìn)率顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 不同年齡組不同部位c-kit受體陽性積分光密度

胃體

空腸

回腸

結(jié)腸

乙狀結(jié)腸

胃體

空腸

回腸

結(jié)腸

乙狀結(jié)腸

3 討 論

約30%～40%老年人均有不同程度的胃腸動力異常，表現(xiàn)為食管括約肌功能障礙，胃排空延遲，小腸通過延長，腸道運動頻率降低，結(jié)腸傳遞時間顯著延長，并且在體外對膽堿能和電刺激的敏感性下降，其便秘、功能性消化不良等疾病的發(fā)生率亦增高。但目前臨床上對人體胃腸動力與年齡老化相關(guān)的改變尚認(rèn)識不足。本實驗結(jié)果提示，在大鼠生理性衰老過程中，腸道推進(jìn)率隨年齡增長逐漸降低。

ICC是消化道運動的起搏細(xì)胞，產(chǎn)生和傳播胃腸道慢波節(jié)律，形成胃腸道平滑肌的節(jié)律性收縮。同時ICC細(xì)胞與腸神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞及消化道平滑肌細(xì)胞存在著緊密的連接，是腸神經(jīng)元向平滑肌細(xì)胞傳導(dǎo)神經(jīng)沖動的中介結(jié)構(gòu)和功能單位。目前國內(nèi)外的一系列研究顯示消化道ICC數(shù)量、分布以及結(jié)構(gòu)的異?？梢栽斐晌改c慢波節(jié)律的異常以及腸神經(jīng)元與平滑肌細(xì)胞之間沖動傳導(dǎo)的障礙，進(jìn)一步則可以導(dǎo)致胃腸運動功能障礙，從而引起胃食管反流、胃輕癱、慢性假性腸梗阻及慢傳輸型便秘、賁門失弛緩癥、嬰兒肥厚性幽門狹窄，嬰兒特發(fā)性胃穿孔、先天性腸閉鎖、先天性巨結(jié)腸及肛門直腸畸形及肛門內(nèi)括約肌弛緩不能〔6～9〕。間葉ICC前體表達(dá)c-kit受體，c-kit受體細(xì)胞外區(qū)域含SCF結(jié)合位點，在不同來源的kit的作用下間葉ICC前體可分化成兩類ICC：肌間ICC(ICC-MY)和肌肉ICC(ICC-IM)。當(dāng)編碼kit或SCF的基因位點發(fā)生突變、kit信號途徑受損后，ICC增生和分化受到影響。在動物實驗中，Torihashi等〔10〕證實在出生后第8天的腸肌叢ICC培養(yǎng)液中加入抗c-kit受體單抗ACK2后，ICC最終不能發(fā)育成熟，并再腸肌叢消失，并且用中和抗體封閉了c-kit受體后，可導(dǎo)致成熟ICC再分化呈平滑肌細(xì)胞樣表型。W位點的變異可完全或部分的阻斷c-kit蛋白的表達(dá)，引起胃腸平滑肌電和機(jī)械活動的異常。Isozaki等〔11〕用原位雜交方法顯示+/+對照大鼠胃肌間神經(jīng)叢c-kit 受體mRNA表達(dá)的ICC分布均勻，而在所有Ws/Ws大鼠均未檢測到c-kit Mrna；在+/+對照大鼠小腸，c-kit mRNA陽性的ICC線性分布于肌間神經(jīng)絲和接近黏膜下的神經(jīng)叢，在Ws/Ws大鼠小腸僅有少量ICC分布。Ordog等〔12〕將剛出生的小鼠胃與kit中和抗體ACK2共同孵育，14～48 d后，7塊組織的kit陽性細(xì)胞完全消失，另7塊組織孵育9～41 d后，kit陽性細(xì)胞在局部組織仍存在，但染色淡。這都說明了kit-SCF系統(tǒng)對ICC發(fā)育的重要作用。因此通過檢測消化道ICC表達(dá)c-kit受體蛋白的水平可以觀察消化道ICC的分布情況及揭示ICC的細(xì)胞功能情況。

大鼠生理性衰老過程中的各項指標(biāo)的觀測結(jié)果及變化規(guī)律，同樣可以對應(yīng)到人體在生理性衰老過程中的變化規(guī)律。根據(jù)本實驗結(jié)果，推測在人體生理性衰老過程中，胃腸ICC細(xì)胞的c-kit受體表達(dá)隨年齡而逐漸下調(diào)，導(dǎo)致ICC的數(shù)量明顯減少及其作為消化道慢波起搏和介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的功能發(fā)生障礙，則老年人胃腸的運動功能發(fā)生極大的降低。上述變化可能是老年人功能性便秘的發(fā)病機(jī)制之一。但是由于神經(jīng)、胃腸激素在消化道運動、分泌和感覺等方面作用的復(fù)雜性，對于其具體機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究和探索。

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