烏司他丁對膿毒癥肺損傷大鼠HO-1表達(dá)的影響及保護(hù)作用

趙 利 程青虹 曾建瓊 何永來 張忠雙 張海俊

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院ICU，新疆 石河子 832008)

膿毒癥發(fā)生率高、病死率高，成為重癥監(jiān)護(hù)病房內(nèi)非心臟病人死亡的主要原因〔1，2〕。肺組織有其防御機(jī)制，能夠緩解或抑制炎癥反應(yīng)所致的肺損傷，其中血紅素加氧酶(HO)是組織細(xì)胞保護(hù)酶和抗氧化劑，能夠?qū)?nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷動物模型起保護(hù)作用，臨床上以HO-1的表達(dá)量作為組織氧化應(yīng)激水平的重要參考。本研究觀察烏司他丁(UTI)對膿毒癥早期肺損傷的保護(hù)作用以及治療后肺組織中HO-1表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 120只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量170～240 g，7～10周齡〔合格證號No.0014065,許可證號SYXK(粵),2003-0001〕。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2實驗試劑 UTI注射液(天普洛安)：廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040505，2011-11-08。氯化鈉注射液：中國大冢制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H12020010，2010-09-30。10%水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司，國藥準(zhǔn)字H37022673。其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1分組 選取120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組和UTI組各40只。膿毒癥組和UTI組采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建模，假手術(shù)組，開腹后不做處理，僅縫合。

1.3.2建模 實驗前禁食12 h。給藥前，采用10%水合氯醛生理鹽水0.3 ml/100 g行舌靜脈注射進(jìn)行全身麻醉。麻醉后，常規(guī)消毒皮膚，在無菌條件下開腹，作長為2 cm的切口，將盲腸移出腹腔，用絲線于回盲瓣和盲腸末端1/2處結(jié)扎盲腸根部。用9號注射針頭于盲腸端選取相距3 mm的點穿刺3處，在穿刺孔處輕微擠出糞渣1滴后逐層縫合腹腔，強(qiáng)力碘消毒包扎傷口，防止手術(shù)切口感染。術(shù)后給予大鼠皮下注射5 ml/100 g生理鹽水補(bǔ)充術(shù)中體液流失。觀察大鼠的存活情況，以72 h死亡率70%～80%作為理想的膿毒癥模型。UTI組：大鼠術(shù)后0、12、24 h給予舌下靜脈注射UTI 50 000 U/kg；假手術(shù)組和膿毒癥組在相同的時間點注射等量生理鹽水；各組給藥后，于6、12、24 h處死大鼠。

1.4考察指標(biāo) (1)采用蘇木素-伊紅(HE)染色法，取肺組織觀察其病理變化；采用HE將肺組織石蠟切片染色1.5 min后自來水沖洗1 min去除多余色素，用1%鹽酸乙醇分化7 s后自來水沖洗10 min，HE復(fù)染2 min，接著分別用70%、80%、90%、95%乙醇分化5 s，最后透明劑10 min。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化，并于圖像采集系統(tǒng)中隨機(jī)選取10個高倍(400×)視野圖片觀察結(jié)果。(2)Western 印跡法測定HO-1表達(dá)情況，以actin作為內(nèi)參照，以actin灰度值比值即為HO-1蛋白相對表達(dá)量。(3)采用Realtime PCR法測定HO-1 mRNA水平變化。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后掃描，用SD2.0軟件分析其Ct值，計算各標(biāo)本平均Ct值，Ct=HO-1 Ct值-actin Ct值(Ct值越低，目的基因的相對表達(dá)量越高)，計算標(biāo)準(zhǔn)化后2-Ct值表示mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理變化 術(shù)后6、12、24 h不同時間點，膿毒癥組較假手術(shù)組在肺出血、肺水腫、肺泡間隔、炎性細(xì)胞浸潤等病理上，變化越來越顯著。而經(jīng)過UTI作用，UTI組其肺組織病理變化較膿毒癥組明顯減輕。見圖1。

2.2Western 印跡法觀察肺組織HO-1蛋白 術(shù)后6、12、24 h各時間點HO-1蛋白表達(dá)膿毒癥組較假手術(shù)組均增多，于12 h和24 h UTI組較膿毒癥組表達(dá)減少(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3Realtime PCR法觀察肺組織HO-1水平變化 術(shù)后6、12、24 h各時間點UTI組、膿毒癥組HO-1 mRNA的表達(dá)均多于假手術(shù)組；術(shù)后12、24 h，UTI組HO-1mRNA水平明顯低于膿毒癥組(P<0.05)。見圖3。

圖1 肺組織病理變化(HE染色,×200)

表1 各組在不同時間點HO-1蛋白表達(dá)

圖2 肺組織HO-1蛋白的表達(dá)

圖3 HO-1 mRNA水平變化

3 討 論

CLP建模是有效模擬與臨床相關(guān)的膿毒癥模型的有效方法，可模擬出臨床患者的肺內(nèi)病理改變以及內(nèi)源性多細(xì)菌感染〔4〕。膿毒癥是全身的炎癥反應(yīng)，常見于危重術(shù)后并發(fā)癥，甚至可致危重患者死亡〔5〕。HO是血紅素分解代謝過程中的限速酶，因為環(huán)境、各式細(xì)胞壓力的催化或其他結(jié)構(gòu)無關(guān)的藥物等因素催化，HO-1的表達(dá)量會有所增加。此外，若有物理或者化學(xué)性的刺激，HO-1基因會因組織和細(xì)胞的誘導(dǎo)發(fā)生編碼、轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致HO-1蛋白水平升高。結(jié)合近年來的研究〔6〕，對HO-1抵抗細(xì)菌性膿毒癥的機(jī)制有所發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)有研究〔7,8〕表明，HO-1在肺缺血再灌肺損傷、呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的模型中，其表達(dá)均有上升，對肺靶器官有保護(hù)作用。在本實驗中，觀察到假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)肺組織水腫、紅細(xì)胞浸潤和炎性細(xì)胞等，肺泡間隔也并無增厚。膿毒癥組肺組織結(jié)構(gòu)不連貫，有間斷，可觀察到肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞，出現(xiàn)肺泡間隔增厚以及肺組織腫脹。在術(shù)后6 h，UTI組存在上述病理變化，且病理水平一致，但隨著時間延長，UTI組較膿毒癥組明顯減輕，可推測UTI對膿毒癥早期肺損傷有保護(hù)作用。

此外，大量研究〔9〕表明，HO-1/膽紅素/CO共同組成了機(jī)體不可缺少的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，廣泛參與多種急慢性氧化應(yīng)激損傷，在多種疾病中起重要作用。HO-1基因缺乏可導(dǎo)致心、肺、腎、腦等多種疾病的損失，增加死亡率，反之，人為調(diào)高HO-1表達(dá)可有效增強(qiáng)組織和細(xì)胞抗損傷的能力〔10〕。本結(jié)果顯示UTI能明顯提高肺損傷大鼠HO-1 mRNA和蛋白在肺組織中的表達(dá)，由此推測UTI是通過提高HO-1表達(dá)而發(fā)揮抗氧化損傷的作用，這也可能是UTI治療膿毒癥肺損傷的機(jī)制之一。

UTI系從人尿提取精制的糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑。能夠通過抑制胰蛋白酶等各種胰酶活性作用，改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，有效防止手術(shù)刺激引起的對內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時的循環(huán)狀態(tài)等〔11〕。其作用機(jī)制是通過抑制粒細(xì)胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶等的活性，從而促進(jìn)酶降解〔12,13〕。UTI對腎臟、肝臟和肺的功能有保護(hù)作用〔14〕，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床上各種休克及大手術(shù)時的臟器功能保護(hù)，或者輔助治療急診嚴(yán)重膿毒癥患者〔15〕。結(jié)合本研究結(jié)果，UTI對膿毒癥肺損傷大鼠確有保護(hù)作用。

以往研究〔16〕中，常采用預(yù)先給藥以研究藥物對膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用，即在建模前給藥，明顯該方法與臨床實際情況不符。臨床上都是在患者發(fā)病后采取措施，因此本研究從實際情況出發(fā)，在發(fā)病初期予以UTI處理，以更接近臨床狀況。本實驗的結(jié)果表明，肺組織中HO-1的產(chǎn)生可提示膿毒癥引起的肺損傷，氧化應(yīng)激水平可通過UTI抑制炎癥因子而改善,間接上調(diào)HO-1的表達(dá),為膿毒癥時對大鼠的肺損傷起保護(hù)作用。

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