三葉因子3在實驗性胃潰瘍大鼠脾臟中的定位及作用

張江蘭 邵素霞 邢琛琨 張 靜 張文靜 張 耕 吳靖芳

(河北北方學院基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，河北 張家口 075000)

最近研究〔1，2〕發(fā)現(xiàn)三葉因子(TFF)家族在調節(jié)免疫反應方面具有重要的作用。Hirota 等〔3〕第一次在大鼠的脾臟中發(fā)現(xiàn)有TFF2 mRNAs和TFF3 mRNAs低水平表達，而后Cook等〔1〕在大鼠淋巴組織中發(fā)現(xiàn)也TFF2和TFF3 mRNA相關肽表達，并且在實驗誘導的免疫反應中h TFF2和h TFF3升高1.5～3倍，并能刺激單核細胞遷移。而對TFF3陽性細胞定位目前國內(nèi)外還沒有進行研究。本研究觀察實驗性胃潰瘍大鼠脾臟中TFF3的定位和表達變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1動物與分組 8周齡SD雄性大鼠共98只。大鼠分為實驗性胃潰瘍組49只，鹽水對照組49只，體重180～220 g。北京維通利華實驗動物技術有限公司購買。

1.2大鼠實驗性胃潰瘍模型的制作及取材 潰瘍組大鼠按冰乙酸致實驗性胃潰瘍模型方法〔4〕，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛，消毒，在無菌條件下(手術切口長約2 cm) 暴露胃。在胃前壁近胃竇處將0.01 ml冰醋酸注入胃黏膜下層。注射后，胃壁表面立即形成一個圓形或橢圓形的隆起，然后該處變?yōu)橐蝗榘咨煌该鲄^(qū)，直徑約5 mm。將大網(wǎng)膜覆蓋于注射區(qū)后，逐層縫合腹壁切口。鹽水對照組模擬手術，注射等量生理鹽水代替冰醋酸。兩組動物飼養(yǎng)條件相同。取材前禁食12 h，不限飲水。動物用30 g/L戊巴比妥鈉麻醉后，迅速開胸，主動脈插管，剪開右心耳，首先灌注生理鹽水100 ml，繼之灌注4% 多聚甲醛250 ml，維持20 min。在造模后1、2、4、6、10、14和23 d分批迅速開腹取脾(N組7只與1 d組同時取材)，從脾截取1 cm長組織條，置于Bouin′s液中固定，12 h后，將組織塊放入70%、80%、90%、酒精中各1 h，95%酒精0.5 h，100%Ⅰ酒精1 h，100%Ⅱ酒精0.5 h，二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明各20 min，60℃下浸蠟2 h。包埋，切片，片厚5 μm，每隔50～60 μm取1 片，每張載玻片貼2片，裱貼于涂有APES的載玻片，連續(xù)切片，厚5 μm，裱貼于涂有APES的載片，行蘇木精-伊紅染色和免疫組化染色；取與免疫組化相鄰切片，連續(xù)切片，厚2 μm，裱貼于涂有APES的載片，SABC免疫組化染色。

1.3HE染色 切片經(jīng)脫蠟、染色、脫水、透明和封片，進行組織學觀察。

1.4免疫組織化學方法檢測脾臟TFF3的定位和表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進行枸櫞酸緩沖液(pH6.0)92℃～98℃水浴鍋修復10 min，室溫冷卻；作定位研究的鄰片以枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓修復5 min，室溫冷卻；30 g/L H2O2-甲醇室溫20 min,100 g/L正常羊血清室溫孵育30 min ，傾去多余的血清，滴加兔抗人TFF3多克隆抗體(工作濃度為1∶150，)和兔抗鼠S-100多克隆抗體(工作濃度為1∶100)，購自武漢博士得生物技術有限公司，4℃濕盒中過夜；滴加生物素標記Ⅱ抗，37℃孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育30 min；DAB-H2O2液顯色后，蘇木精復染細胞核。正常兔血清代替一抗作陰性對照，其余步驟相同。在光鏡下觀察TFF3和S-100陽性反應物質呈棕黃色顆粒狀分布于各細胞的胞質中。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細胞。

1.5形態(tài)計量和圖像分析 用OLYMPUS-CX31顯微鏡連接MiE顯微圖像處理軟件在計算機上進行觀察，用Motic Med6.0軟件進行圖像半定量分析，每張切片隨機選取5個視野，每組動物隨機選擇30張照片，用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定TFF3蛋白的平均光密度值(AOD)。

2 結 果

2.1TFF3陽性細胞的定位 三組大鼠脾臟組織中均有TFF3表達。TFF3陽性細胞分布于邊緣區(qū)、白髓及紅髓中的脾索中(圖1)。TFF3陽性反應物呈棕黃色顆粒狀分布于胞質中。正常組TFF3細胞呈淺棕黃色，數(shù)量少；潰瘍組和鹽水組陽性細胞呈棕黃色，數(shù)量多。白髓中TFF3陽性細胞散在分布，形態(tài)不規(guī)則，一般有多個突起，核較大，位于細胞中央；邊緣區(qū)和紅髓中陽性細胞成群或散在分布，數(shù)量較多；而紅髓中陽性細胞散在分布，主要分布于脾索中。經(jīng)鄰片免疫組化結果證實，部分TFF3陽性細胞與S-100表達陽性重疊，因S-100是樹突細胞的標記蛋白，故脾臟中部分TFF3陽性細胞為樹突細胞(圖2)。

2.2TFF3在不同時期大鼠脾臟中的表達變化 不同時期鹽水組(圖3A)大鼠脾臟各部位TFF3表達較弱。TFF3在不同時期胃潰瘍大鼠脾臟中各部位的表達不同，統(tǒng)計結果顯示：白髓：1、2 d組TFF3表達逐漸增強、陽性細胞數(shù)量增多，4、6 d組染色強度稍有降低、數(shù)量增多，10 d 組TFF3陽性信號強度和數(shù)量達高峰(圖3B)，然后14、23 d組陽性細胞強度和數(shù)量逐漸降低，但明顯高于鹽水對照組，2～23 d各潰瘍組TFF3表達均高于鹽水組(P<0.01)；邊緣區(qū)：1 d組TFF3表達逐漸增強、陽性細胞數(shù)量增多，2、4 d各值略有降低，6 d各值增高、陽性信號強度達峰值，10、14 d各值逐漸降低，23 d有所升高，但維持在一個較高的水平，其中6 d組與鹽水組相比明顯增高(P<0.01)。紅髓：1、2 d TFF3表達逐漸增強、數(shù)量增多，4 d各值降低，6 d各值增高、其陽性信號強度高峰，10、14、23 d各值下降，但維持較高水平，其中6 d組與鹽水組相比明顯增高。見表1。

表1 TFF3陽性細胞AOD變化

圖1 潰瘍組TFF3及S-100陽性細胞分布

圖2 潰瘍組鄰片TFF3和S-100免疫組化染色(×330)

圖3 鹽水組與潰瘍組中TFF3陽性細胞分布(×200)

3 討 論

TFF3是Suemopr等〔5〕于1991 年在大鼠空腸黏膜中發(fā)現(xiàn)。TFF3存在單聚體及二聚體2種形式，其同源二聚體通過2個C末端半胱氨酸(Cys58)形成分子間二硫鍵連接而成，是胃腸黏膜的一個重要的保護因子，與胃腸黏膜的損傷、修復、增殖、惡變有著重要的關系〔6〕。本研究通過應用敏感的免疫組織化學SABC法發(fā)現(xiàn)，TFF3陽性細胞體積較大、星形或有突起，細胞核較大；也有少量表達于圓形、橢圓形的細胞中，胞核圓形或卵圓形，位于胞質中央或偏位。DC細胞質可以合成一種為S-100的胞漿蛋白，八九十年代以來，陸續(xù)有研究報道〔7，8〕S-100蛋白是郎交錯突細胞的一個標志。本研究結果證實部分TFF3陽性細胞與鄰片中S-100陽性DC重合，提示這部分TFF3陽性細胞是S-100陽性的DC，故認為部分TFF3是由S-100陽性的DC合成的。

研究〔9〕顯示，脾臟體積增大，白髓脾小體增多，且生發(fā)中心清晰。B細胞受到特異性抗原刺激增殖活化，轉化為效應細胞漿細胞，漿細胞分泌免疫球蛋白后，大部分免疫球蛋白發(fā)生糖基化比如黏合素，Cook等〔1〕用細胞質基因組共振光譜檢測TFF2或TFF3與IgG或IgA有一定的相關性，提示可能通過影響漿細胞免疫球蛋白的分泌活動來提高體液免疫應答。Alision等〔10〕研究恰好解釋了制模后的第1天分泌TFF3急劇增多，指出一方面可能是由于生理應激性引起，另一方面TFF3為早期反應基因。本文顯示在潰瘍愈合早期TFF3高表達可能提高了脾臟的免疫反應性，加快了胃潰瘍的愈合，胃潰瘍自愈后期，TFF3表達減弱，脾免疫作用趨于正常。

HE染色顯示在潰瘍組早期脾臟邊緣區(qū)依次增厚，可見邊緣區(qū)免疫反應在潰瘍早期是增強的。DC 通過在體內(nèi)遷移而發(fā)揮強大的抗原提呈功能，從外周非淋巴組織遷移進入次級淋巴組織〔11〕，如肝臟內(nèi)的DC獲取抗原后通過血液循環(huán)到脾臟〔12〕，激發(fā)抗原特異性的免疫反應。DC移行到脾臟T細胞區(qū)定居下來,誘導產(chǎn)生Th1型免疫應答,或通過激活B細胞產(chǎn)生特異性抗體,清除抗原性物質。本研究認為，潰瘍形成和愈合早期脾的組織學改變，是由于在實驗性胃潰瘍早期，與冰乙酸刺激和局部潰瘍形成有關，黏膜免疫細胞大量處理抗原，隨淋巴細胞再循環(huán)到達脾臟，首先引起邊緣區(qū)的改變。本研究還表明，在潰瘍組損傷后的不同時間段，邊緣區(qū)TFF3表達是不同的，總體上，邊緣區(qū)TFF3的表達與損傷發(fā)生后的時間呈負相關〔9〕，可見隨潰瘍愈合，潰瘍局部抗原成分減少，TFF3表達減少。侯國存等〔13〕證實在多器官障礙綜合征早期,脾DC大量增加并從脾臟白髓邊緣區(qū)向T細胞區(qū)遷移,引發(fā)過度免疫反應。Cook等〔1〕在體外培養(yǎng)大鼠脾臟來源的DC培養(yǎng)基中加入人糖基化的TFF2和TFF3重組體，實驗結果發(fā)現(xiàn)hTFF2和hTFF3升高1.5～3倍，能刺激單核細胞遷移能力增強。所以我們推測潰瘍期間脾臟TFF3能促進免疫細胞的遷移和淋巴細胞再循環(huán)，利于潰瘍大鼠自身免疫力的提高。

總之，大鼠胃潰瘍自愈期間，脾臟不同的部位TFF3表達水平不同，但胃黏膜損傷早期脾臟TFF3呈高水平表達，對提高機體免疫反應性及促進胃黏膜修復有重要作用。

4 參考文獻

1Cook GA,Pamilari M,Thim L,etal.The TFF2 and TFF3 are expressed in rat lymphoid tissues and participate in the immune response〔J〕.FEBS Letters，1999；456:155-9.

2Raja SB，Murali MR，Devaraj H,etal.Differential expression of gastric MUC5AC in colonic epithelial cells：TFF3-wired IL1 β/Akt crosstalk-induced mucosal immune response against Shigella dysenteriae infection〔J〕.J Cell Sci，2012；125(3):703-13.

3Hirota M,Miyashita S,Hayashi H,etal.pS2 gene especially expressed in the late G1/S phase of mouse astrocytes〔J〕.Neurosci Lett，1994；171:49-51.

4吳靖芳,顧彩霞,張 靜,等.大鼠實驗性胃潰瘍期間下頜下腺TFF3基因的變化〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志,2010；19：26-31.

5Suemori S，Lynch-devaney K，Podolsky DK.Identification and characterization of rat intestinal trefoil factor：tissue and cell-specific member of the trefoil protein family〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1991；88:11017-21.

6Calcagno SR，Li S，Shahid MW,etal.Protein kinase C iota in the intestinal epithelium protects against dextran sodium sulfate-induced colitis〔J〕. Inflamm Bowel Dis，2011;17(8):1685-97.

7Brandtzaeg P.Immunohistochemical identification of macrophages and various dendritic cells in Paraffin embeded biopsy material〔J〕.AFMIS，1988；96:136.

8張錦坤，魏錫云，陳海濱，等.大鼠脾白髓交錯突細胞和巨噬細胞的形態(tài)計量分析〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，1996；5(3)：321-4.

9張江蘭,吳靖芳,王志勇，等.三葉因子3在胃潰瘍大鼠脾臟不同部位的表達〔J〕.西安交通大學學報(醫(yī)學版),2011；32(3):315-9.

10Alision MR,Chiner YR,Poulsom R,etal.Experimental ulceration leads to sequential expression of spasmolytic polypeptide，intestinal polypeptide，intestinal trefoil factor and transforming growth factor alpha mRNA in rat stomach〔J〕.Pathol，1995；175(4):405-14.

11楊俊俊,徐興祥,錢桂生.樹突狀細胞引流淋巴結歸巢的研究進展〔J〕.免疫學雜志，2011；27(3):263-6.

12Young JW，Inaba K.Dendritic cells as adjuvants for class Ⅰ major histocompatibility complex-restricted antitumor immunity〔J〕.J Exp Med，1996；183(1):7-11.

13侯國存,劉 茜,王宏偉,等.樹突狀細胞在多器官功能障礙綜合征小鼠脾臟中的遷移變化及意義〔J〕.解放軍醫(yī)學雜志,2009；34(3):290-2.