Na+/H+交換泵抑制劑EIPA對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響

張 曉 齊海智 賀志軍 胡 偉 司中州 李一寧

(鄭州大學人民醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450000)

細胞膜離子交換蛋白Na+/H+交換泵(NHE)是存在于所有真核細胞的一種跨膜蛋白，NHE1是其中最主要且最普遍存在的一種亞型，在調節(jié)細胞內pH值和細胞容量、維持Na+和Ca2+穩(wěn)態(tài)方面起重要作用〔1〕。大量研究表明NHE1抑制劑具有保護心肌的作用〔2〕，而NHE1抑制劑在肝缺血再灌注方面研究較少〔3〕。本試驗通過比較NHE1抑制劑EIPA預處理對大鼠肝臟缺血再灌注后血清轉氨酶、肝組織中MPO活性、細胞水腫程度及肝組織Ca2+濃度的影響，探討EIPA對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及機制。

1 對象與方法

1.1材料及分組 30只成年健康SD大鼠，平均體重(201.8±19.37)g，由中南大學湘雅二醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機分為空白組，缺血再灌注組，EIPA預處理+缺血再灌注組(EIPA預處理組)，每組10只。

1.2實驗過程及標本采集 大鼠在試驗前禁食12 h、禁水4 h，稱重后按3%戊巴比妥鈉1 mg/kg經腹腔注射實施麻醉。采用Pringle′s法，用無損傷心耳鉗阻斷肝動脈和門靜脈，建立95%缺血模型?？瞻捉M開關腹不阻斷肝門；EIPA預處理組阻斷肝門前10 min注射生理鹽水+EIPA溶液(EIPA+DMSO，EIPA為粉狀藥劑，僅溶于DMSO、酒精中，故本試驗采用DMSO作為溶劑)1.0 mg/kg，然后靜滴EIPA溶液0.01 mg·kg-1·min-1，維持15 min；缺血再灌注組阻斷肝門前10 min注射等量的生理鹽水+DMSO。EIPA預處理、缺血再灌注兩組缺血時間均為30 min，再灌注2 h后取標本。

采血時直接穿刺肝上、下腔靜脈取血，檢測血清轉氨酶(ALT，AST)。取少量肝右葉肝組織，作肝組織勻漿檢測髓過氧化物酶(MPO)活性。取少量肝右葉組織測其濕/干比，了解細胞水腫程度。留干燥肝組織檢測Ca2+濃度。取少量肝左葉組織制成組織切片，檢查組織形態(tài)學。

1.3藥品，試劑和儀器 ①EIPA由美國Alexis公司提供；DMSO由加拿大Biosharp公司提供。②MPO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4檢測方法 (1)MPO的檢測：嚴格按照MPO測試盒說明書進行；(2)ALT，AST測定：采用半自動生化分析儀，常規(guī)生化法，由專業(yè)檢驗人員檢測；(3)肝組織水腫程度檢測：取少量肝右葉組織吸至表面干燥后，稱重，放入烤箱中干燥至恒重后再次稱重，計算濕/干比；(4)肝組織Ca2+濃度檢測：采用火焰原子吸收法檢測，由中南大學現代分析檢測中心專業(yè)人員操作；(5)肝細胞形態(tài)學觀察：將少量肝左葉組織以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察，由專業(yè)病理醫(yī)師對肝臟組織損傷情況進行判定。

2 結 果

2.1各組ALT、AST、肝組織Ca2+濃度、濕/干比、MPO活性結果比較 見表1。

2.2各組肝組織病理形態(tài)學變化 分別于10×10倍及10×40倍光鏡下觀察，可見空白組肝細胞結構正常，肝竇正常；缺血再灌注組與EIPA預處理組均有形態(tài)學改變，且EIPA預處理組較缺血再灌注組肝細胞壞死、淤血及中性粒細胞浸潤程度均減輕，見表2。

表1 各組ALT、AST、肝組織Ca2+濃度、濕/干比、MPO活性比較

表2 100倍光鏡下各組大鼠肝病理形態(tài)學改變(n)

3 討 論

肝臟缺血再灌注損傷的確切機制不明，已知氧自由基生成和鈣超載在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。而近年來研究表明，白細胞特別是中性粒細胞(PMN)在肝臟缺血再灌注損傷中也發(fā)揮重要作用〔4〕。

NHE1作為一種普遍存在于所有組織細胞中的管家基因，在生理條件下表達極低。以往研究表明，其在缺血再灌注時被激活，引起細胞內Na+/Ca2+交換紊亂，最終引起鈣超載，對細胞造成傷害〔2〕。

本實驗數據表明EIPA預處理后血清轉氨酶、肝組織Ca2+濃度及濕/干比顯著降低，其原因可能為EIPA抑制了缺血期細胞缺氧代謝時由于〔pH〕i升高而被激活的NHE1，糾正了Na+的內流與泵出失衡，抑制了細胞內Na+超負荷，進而間接抑制了細胞內鈣超載，從而減輕了由于細胞內鈣超載而導致的炎性介質及氧自由基的生成、細胞能量代謝障礙〔5〕等。另外，EIPA降低了〔Na+〕i，防止了細胞內滲透壓上升，避免了細胞的腫脹及微循環(huán)障礙〔6〕，從而起到保護肝細胞的作用。

Jaeschke等〔7〕在小鼠肝臟再灌注模型中發(fā)現PMN在再灌注初期就開始聚集并進行性增多，用抗白細胞血清消耗白細胞后肝臟損傷的程度減輕。因此，可認為激活的PMN是引起肝實質細胞損傷和肝組織結構破壞的關鍵細胞。MPO是存在于中性粒細胞內的一種耐高溫酶，是急性炎癥階段中性粒細胞在組織中聚集程度的指標。肝組織內MPO含量增加說明中性粒細胞的聚集增加。

本實驗數據表明，與缺血再灌注組比較，EIPA預處理組肝組織MPO活性顯著降低。由于NHE1也是PMN上的重要亞型，且PMN的黏附和吞噬作用通常都有活化的NHE參與〔8〕。Gumina等〔9〕研究發(fā)現NHE抑制劑具有抑制PMN積聚與黏附的作用，體外細胞實驗認為NHE抑制劑可減弱PMN的趨化性和突發(fā)性呼吸作用〔10〕。因此，可認為通過抑制I/R中PMN激活從而減少了PMN在肝組織內的聚集，抑制了氧自由基、炎性介質及水解酶類的產生，進而對肝細胞發(fā)揮保護作用。病理切片中可以看出，EIPA預處理組PMN聚集程度及肝細胞變性壞死程度明顯較缺血再灌注組減輕，也說明了這一點。

4 參考文獻

1Cabral JM，Soares-da-Silva P，Magro F.Short-and long-term regulation of intestinal Na+/H+ exchange activity associated with TLR2 receptor activation is independent of nuclear factor-κB signaling〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2013;346(3)：453-64.

2陳長勛，金若敏.NHE1抑制劑對缺血及再灌流心肌的保護作用〔J〕.中國藥理學通報，2001;17(5)：489-92.

3Wang D，Dou K，Song Z，etal.The Na+/H+ exchange inhibitor：A new therapeutic approach for hepatic ischemia injury in rats〔J〕.Transplant Proc，2003;35(8)：3134-5.

4臧秀娟，宮 麗，洪海娟，等.中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白對大鼠腎臟缺血再灌注損傷腎小管上皮細胞的保護作用〔J〕.中華腎臟病雜志，2012;28(10)：804-7.

5Hosogi S，Miyazaki H，Nakajima K，etal.An inhibitor of Na(+)/H(+) exchanger (NHE)，ethyl-isopropyl amiloride (EIPA)，diminishes proliferation of MKN28 human gastric cancer cells by decreasing the cytosolicCl(-) concentration via DIDS-sensitive pathways〔J〕.Cell Physiol Biochem，2012；30(5)：1241-53.

6張 曉.Na<′+>/H<′+>交換泵抑制劑EIPA在大鼠肝熱缺血再灌注損傷模型中的實驗研究〔D〕.長沙中南大學，2006.

7Jaeschke H，Farhood A.Neutrophil and kupffer cell-induced oxidant stress and ischemia reperfusion injury in rat liver〔J〕.Am J Physiol，1991；260(3)：335-62.

8Emami H，Talab SS，Nezami BG，etal.Na(+)-H+ exchange inhibition attenuates ischemic injury in rat random pattern skinflap：the role of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels〔J〕.Eur J Pharmacol，2013；698(1-3)：330-4.

9Gumina RJ，Auchampach J，Wang R，etal.Na+/H+ exchange inhibition induced cardioprotection in dogs：effects on neutrophils versus cardiomyocytes〔J〕.Am J Physiol，2000；279(4)：1563-70.

10Undem C，Rios EJ，Maylor J，etal.Endothelin-1 augments Na/H exchange activity in murine pulmonary arterial smooth muscle cells via Rho kinase〔J〕.PLoS One，2012；7(9)：e46303.