occludin、ZO-1在不同來源血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)差異

唐堅(jiān)清 陳 圣 陳林鶯 張 聲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建 福州 350005)

緊密連接(tight junction，TJ) 是由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用而形成的一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系〔1〕。它們共同構(gòu)成環(huán)繞細(xì)胞的線狀結(jié)構(gòu)，這些物質(zhì)共同起作用，維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。TJs中最重要的是跨膜蛋白o(hù)ccludin與胞質(zhì)附著蛋白ZO家族及細(xì)胞內(nèi)與其相連的細(xì)胞骨架蛋白。其中occludin是第一個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接的組成膜蛋白，許多學(xué)者曾認(rèn)為，它是構(gòu)成緊密連接的主要成分〔2〕，是TJ中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅能通過外環(huán)以拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)密的細(xì)胞旁封閉，還能與不同的分子結(jié)合，參與TJ形成的信號調(diào)節(jié)〔3〕。研究表明，occludin蛋白表達(dá)于各種細(xì)胞與組織中，如涎腺腺泡上皮與導(dǎo)管上皮、角膜上皮細(xì)胞、泌尿系統(tǒng)上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等，occludin在動、靜脈系統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中也均有表達(dá)，并且動脈性血管內(nèi)皮細(xì)胞中其表達(dá)量要高于靜脈性血管內(nèi)皮細(xì)胞〔4〕，而血液屏障功能很大程度上與血管內(nèi)皮細(xì)胞的occludin表達(dá)量相關(guān)，如在血-腦屏障及血-視網(wǎng)膜屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞中其表達(dá)量要明顯高于其他的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這對于調(diào)節(jié)血液屏障的通透性起了至關(guān)重要的作用〔5，6〕。ZO-1與其同源異構(gòu)體ZO-2，ZO-3一起，為緊密連接的許多跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺，維持和調(diào)節(jié)上皮屏障功能；同時還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、維持上皮極性、細(xì)胞增殖分化、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等重要過程；它同樣表達(dá)于各種組織和細(xì)胞中，如血管內(nèi)皮、泌尿系統(tǒng)上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、消化道上皮等〔7〕。occludin、ZO-1在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)和分布與內(nèi)皮細(xì)胞的通透性密切相關(guān)。occludin、ZO-1在各種不同的惡性腫瘤中的表達(dá)分析為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但二者在不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平是否存在差異，國內(nèi)外均未見相關(guān)報道。為進(jìn)一步了解occludin、ZO-1在不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況差異，以及該差異是否具有臨床意義，本實(shí)驗(yàn)利用組織芯片技術(shù)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測occludin、ZO-1在低-未分化胃癌、高-中分化胃癌、幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍靜脈5種標(biāo)本中血管內(nèi)皮細(xì)胞中的分布與表達(dá)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 低-未分化胃癌、高-中分化胃癌、幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍靜脈標(biāo)本均取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009～2010年手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊各20例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療和化療。免抗人occludin多克隆抗體、免抗人ZO-1多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化染色超敏試劑盒購自美國Labvision公司；DAB顯色試劑盒購自美國DAKO公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織芯片的制備 本實(shí)驗(yàn)采用5×4點(diǎn)陣芯片，將每組標(biāo)本各20例置于一塊芯片上，每種芯片各制備3塊，共制備組織芯片蠟塊15塊，每個芯片蠟塊均設(shè)置內(nèi)標(biāo)記。

1.2.2免疫組化染色方法及結(jié)果判定 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行occludin、ZO-1免疫組化3步法染色。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，用已知陽性對照片作陽性對照，陰性對照以0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步驟不變。

顯微鏡下觀察，occludin免疫組化染色陽性定位于內(nèi)皮細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀，根據(jù)染色深淺程度及染色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率，將染色結(jié)果分為(-)、(+)、()、()4個等級，并將其中<()者定為低表達(dá)，≥()者定為高表達(dá)。ZO-1免疫組化染色陽性定位于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)染色部位，將染色結(jié)果分為3個等級，并給予評分；染色僅定位于細(xì)胞質(zhì)的定義為(+)，評分1分；染色準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜的定義為()，評分3分；既有胞漿染色又有胞膜染色的定義為()，評分2分〔8〕；同時根據(jù)ZO-1染色的深淺程度分為(+)～()(1～3分)，結(jié)合染色定位與染色深淺程度，根據(jù)二者乘積將染色結(jié)果分為(+)～()，結(jié)果≥()者定義為高表達(dá)，<()者定為低表達(dá)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1occludin在五組標(biāo)本中血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，occludin陽性定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，在五組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中著色深淺不一，呈點(diǎn)狀或散在分布，且染色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比有所不同。見圖1。

A：在高-中分化胃癌組，occludin在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞呈較高表達(dá)，陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞膜與胞質(zhì)；B：在低-未分化胃癌組，occludin在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞呈低表達(dá)，染色強(qiáng)度低；C：在幼年性毛細(xì)血管瘤組，occludin呈高表達(dá)，染色強(qiáng)度高，染色細(xì)胞數(shù)多

根據(jù)陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)五組不同標(biāo)本中，血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin的高表達(dá)率分別為10%、40%、75%、75%及95%。其中低-未分化胃癌組occludin高表達(dá)率最低，臍帶組occludin高表達(dá)率最高，根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，可以認(rèn)為五組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞的occludin表達(dá)不全相同(P<0.001)。見表1。

通過對低-未分化胃癌組及高-中分化胃癌組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞ccludin表達(dá)情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且胃癌組標(biāo)本與其余非癌組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表2)，而幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍帶組標(biāo)本之間occludin表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 Occludin在五組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)比較〔n(%)，n=20〕

表2 occludin在胃癌組及非癌組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況比較〔n(%)〕

2.2ZO-1在五組標(biāo)本中血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZO-1陽性定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，在五組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中定位不同且著色深淺不一，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色；在幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜及臍帶標(biāo)本中，ZO-1定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜，未見明顯的迷離表達(dá)；在低-未分化胃癌及高-中分化胃癌標(biāo)本中，ZO-1表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿，呈現(xiàn)一定程度的迷離表達(dá)。見圖2。

A：在高-中分化胃癌組，ZO-1在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞呈較高表達(dá)，陽性染色定位于內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜與胞漿，呈現(xiàn)迷離表達(dá)；B：在低-未分化胃癌組，ZO-1在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞呈低表達(dá)，染色強(qiáng)度低，且迷離表達(dá)于胞漿中；C：在幼年性毛細(xì)血管瘤組，ZO-1呈高表達(dá)，染色強(qiáng)度高，且定位于細(xì)胞膜，未見迷離表達(dá)

根據(jù)陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)五組不同標(biāo)本中，血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1的高表達(dá)率分別為25%、60%、95%、65%及85%。其中低-未分化胃癌組ZO-1高表達(dá)率最低，幼年性毛細(xì)血管瘤組ZO-1高表達(dá)率最高，根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，可以認(rèn)為5組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞的ZO-1表達(dá)率差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表3。

通過對低-未分化胃癌組及高-中分化胃癌組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1表達(dá)情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且胃癌組標(biāo)本與其余非癌組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)，而幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍帶組標(biāo)本之間occludin表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 ZO-1在5組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)比較〔n(%)，n=20〕

表4 ZO-1在胃癌組及非癌組標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況比較〔n(%)〕

3 討 論

腫瘤性血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要前提條件，緊密連接和黏附連接與細(xì)胞的增殖和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也是近年腫瘤研究的熱點(diǎn)問題，而關(guān)于緊密連接在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)情況國內(nèi)外研究甚少。

緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能異常是人類上皮性腫瘤的共同特點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)occludin與ZO-1的表達(dá)水平在多種惡性上皮性腫瘤中均與腫瘤分化程度及浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Tobioka等〔9〕發(fā)現(xiàn)在高級別子宮內(nèi)膜癌中occludin的表達(dá)量顯著低于在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜增生中的表達(dá)水平，并且隨著腫瘤惡性程度的增加，occludin的表達(dá)也逐漸減少，并且occludin的表達(dá)降低與腫瘤的肌層浸潤和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)；本科室陳虹等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)occludin在胃癌中的表達(dá)量低于癌旁正常組織， occludin與胃腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并隨著胃腺癌的侵襲進(jìn)展occludin的表達(dá)水平顯著下降；另外Martin 等〔11〕發(fā)現(xiàn)ZO-1在乳腺癌及周圍正常組織的表達(dá)模式不同，在癌組織中ZO-1呈迷離表達(dá)，并且ZO-1的表達(dá)降低提示病人的預(yù)后差；本科室鄭珂等〔12〕亦發(fā)現(xiàn)Z0-1的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有相關(guān)性，分化程度低、浸潤深度深、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及進(jìn)展期胃腺癌的黏膜層胃腺癌細(xì)胞ZO-1迷離表達(dá)程度較高。

緊密連接和黏附連接作為上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間最頂端的結(jié)構(gòu)，主要是維持表皮和內(nèi)皮細(xì)胞的選擇滲透性屏障功能，與細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成密切相關(guān)。跨膜蛋白o(hù)ccludin及胞漿蛋白ZO-1是緊密連接的主要組成成分，二者的高濃度表達(dá)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征及功能基礎(chǔ)，對保持緊密連接的完整性起到關(guān)鍵作用，二者表達(dá)的減少或缺失導(dǎo)致血管的通透性增加，可能在癌細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用〔13，14〕。

本研究顯示在低-未分化胃癌、高-中分化胃癌、幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍靜脈等五組標(biāo)本中，occludin及ZO-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)存在差異，并且胃癌標(biāo)本中血管內(nèi)皮細(xì)胞上occludin及ZO-1高表達(dá)率低于非癌組織，低-未分化胃癌組中血管內(nèi)皮細(xì)胞上occludin及ZO-1高表達(dá)率低于高-中分化胃癌，而二者在良性血管源性腫瘤(幼年性毛細(xì)血管瘤)與反應(yīng)性血管增生(淺表性胃炎胃黏膜及臍靜脈)三種組織中均為高表達(dá)，且表達(dá)無顯著差異。筆者同時發(fā)現(xiàn)，在幼年性毛細(xì)血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜及臍帶標(biāo)本中，ZO-1定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜，未見明顯的迷離表達(dá)，在低-未分化胃癌及高-中分化胃癌標(biāo)本中，ZO-1表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿，呈現(xiàn)一定程度的迷離表達(dá)。也就是說，occludin及ZO-1蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量及表達(dá)模式與血管所在的腫瘤組織的分化程度成正相關(guān)，腫瘤組織分化越差，血管內(nèi)皮細(xì)胞上的occludin及ZO-1蛋白表達(dá)量就越低，這與國內(nèi)外研究所報道的occludin及ZO-1蛋白在不同分化的胃腸道腫瘤組織中的分布規(guī)律一致〔15〕，二者是否存在一定的分子聯(lián)系？

Feng等〔16〕實(shí)驗(yàn)證實(shí)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMP-2和MMP-9導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞上occludin及ZO-1降解，導(dǎo)致血管通透性增加，血腦屏障功能障礙，因此白血病細(xì)胞能通過破壞的血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。腫瘤組織產(chǎn)生釋放多種細(xì)胞因子如TNF-α能直接影響緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)與分布，IL-1β通過抑制occludin轉(zhuǎn)錄啟動子活性進(jìn)而導(dǎo)致occludin蛋白表達(dá)下調(diào)〔17〕，Yang等〔18〕研究表明胃癌組織中VEGF-1與MMP-9表達(dá)量顯著增高，二者共同促進(jìn)腫瘤血管的生成與侵襲轉(zhuǎn)移。而且MMP-9 mRNA的過表達(dá)是胃癌患者的不良預(yù)后因素〔19〕。筆者推測腫瘤組織產(chǎn)生的各種因子通過多種途徑導(dǎo)致腫瘤性血管內(nèi)皮細(xì)胞上的occludin及ZO-1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙完整性的破壞，細(xì)胞旁間隙增大，血管通透性增高；而與此同時，腫瘤細(xì)胞本身在這些因子的作用下occludin及ZO-1的表達(dá)也下調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)，腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞表型喪失，間質(zhì)表型獲得，細(xì)胞黏附性下降，活動力增強(qiáng)〔20〕。也就是說，在腫瘤組織與腫瘤性血管內(nèi)皮細(xì)胞上的緊密連接功能的共同降低或缺失，這可能會進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的活動力和遷移能力，離開原發(fā)部位，并導(dǎo)致通過血管途徑的侵襲與轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，易于發(fā)生遠(yuǎn)處浸潤與轉(zhuǎn)移。

總之，深入研究不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白o(hù)ccludin與ZO-1的異常表達(dá)及其機(jī)制，并研究相應(yīng)有效的干預(yù)方法，將有助于對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制的進(jìn)一步深入了解，為腫瘤靶向治療提供新的思路。

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