頭孢三嗪對(duì)腦缺血/再灌注大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用

柴永宏

(山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校內(nèi)科學(xué)教研室，山東 臨沂 276001)

大腦組織的能量?jī)?chǔ)存能力很低，且腦組織中清除自由基的酶含量很少，因此腦組織對(duì)能量供應(yīng)不足十分敏感，尤其容易受到氧自由基的損傷〔1〕。

自由基是強(qiáng)氧化劑，其脂質(zhì)過(guò)氧化作用會(huì)直接造成細(xì)胞膜損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔2〕。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)均為內(nèi)源性抗氧化劑，在氧化腦損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。加強(qiáng)腦組織的抗氧化能力有助于神經(jīng)細(xì)胞從缺血/再灌注損傷中恢復(fù)。

有研究〔3〕報(bào)道β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素有神經(jīng)保護(hù)作用，在缺血性腦損傷中具有抗氧化作用。頭孢三嗪是一種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素其殺菌機(jī)制為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁黏多糖的合成。最近，研究〔4，5〕發(fā)現(xiàn)頭孢三嗪在腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)中有抗氧化作用，但是，其在大鼠大面積腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用、組織氧化及抗氧化水平尚缺乏相關(guān)研究。本研究擬探討頭孢三嗪對(duì)急性腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物處理 分組：隨機(jī)將50只Wistar大鼠分為3組：對(duì)照組(n=10)，缺血/再灌注(I/R)組(n=20)，I/R-頭孢三嗪組(n=20)。對(duì)大鼠進(jìn)行右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)處理，并在90 min后再通血管，制作局灶性腦缺血大鼠模型〔3〕。使用水合氯醛將大鼠全麻后(400 mg/kg)，在頸部中線(xiàn)作切口暴露右側(cè)頸動(dòng)脈分叉處，從頸外動(dòng)脈近端插入栓子，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈后，繼續(xù)插入栓子直至感到有輕微阻力，栓子到達(dá)大腦中動(dòng)脈。栓子尾部留于切口外，90 min后，拔出栓子形成血液再灌注。

I/R-頭孢三嗪組：在對(duì)大鼠進(jìn)行MCAO處理后90 min給予頭孢三嗪(200 mg/kg體重)，一次注射給藥。頭孢三嗪的用量參照文獻(xiàn)〔6〕。隨機(jī)抽取10只大鼠，于再灌注30 min后斷頭處死，剩余大鼠繼續(xù)觀察。

I/R組：在對(duì)大鼠進(jìn)行MCAO處理后90 min給予生理鹽水，一次注射給藥，給藥劑量與I/R-頭孢三嗪組頭孢三嗪的用量相同。隨機(jī)抽取10只大鼠，于再灌注30 min后斷頭處死，剩余大鼠繼續(xù)觀察。

對(duì)照組：接受相同的手術(shù)處理，只是不將栓子插入造成缺血；手術(shù)處理后90 min給予生理鹽水，一次注射給藥，給藥劑量與I/R-頭孢三嗪組中頭孢三嗪的用量相同。

隨后2 d觀察動(dòng)物的情況，第1天對(duì)其神經(jīng)功能狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，第2天通過(guò)MRI觀察梗死體積的變化情況。對(duì)所有大鼠進(jìn)行為期4 w的觀察，以評(píng)價(jià)長(zhǎng)期死亡率。在操作過(guò)程中，大鼠的體溫保持在(37±0.5)℃。

1.2腦組織樣本提取 從I/R組及I/R-頭孢三嗪組中，各隨機(jī)抽取10只大鼠，于再灌注發(fā)生30 min后斷頭處死，快速分離左側(cè)腦組織用于生化分析。將分離的腦組織儲(chǔ)存于-70℃的環(huán)境中，直到進(jìn)行丙二醛(MDA)及氧化氮(NO)水平、SOD及GSH-Px活性分析。

1.3生化分析 稱(chēng)重并均化樣本腦組織(5 000 r/min離心2 min)。將所得勻漿離心60 min去除組織碎片獲得上清液。一部分上清液保存于-40℃的環(huán)境中，1 w后檢測(cè)GSH-Px的活性。一部分上清液與同等體積的乙醇混合，離心30 min，去上層清亮液體，用于檢測(cè)SOD活性及蛋白質(zhì)分析。所有的準(zhǔn)備過(guò)程均在4℃的環(huán)境中進(jìn)行。

1.4腦血流量監(jiān)測(cè) 從手術(shù)開(kāi)始至再灌注后30 min，使用超聲多普勒流量計(jì)通過(guò)連接于大鼠顱骨的探頭(大腦中動(dòng)脈供血區(qū)上方)監(jiān)測(cè)腦血流(CBF)的變化。如果在MCAO發(fā)生后CBF下降達(dá)75%及以上，手術(shù)被認(rèn)為是成功的。

1.5神經(jīng)功能評(píng)分 于MCAO發(fā)生后24 h及7 d對(duì)I/R組及I/R-頭孢三嗪組剩余大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。使用Garcia等提出的18分神經(jīng)功能評(píng)估系統(tǒng)對(duì)大鼠的不自主運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)障礙及感覺(jué)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，嚴(yán)重?fù)p害為1或2級(jí)，未觀察到神經(jīng)功能缺損為3級(jí)。

1.6T2加權(quán)核磁共振成像 MCAO術(shù)后48 h對(duì)I/R組及I/R-頭孢三嗪組剩余大鼠進(jìn)行MRI T2加權(quán)像檢查，分別計(jì)算病灶體積。

2 結(jié) 果

2.1腦血流監(jiān)測(cè) 接受MCAO處理后，與基線(xiàn)水平相比，I/R-頭孢三嗪組及I/R組所有動(dòng)物CBF均下降大于75%，在撤出栓子后，單側(cè)血流量恢復(fù)到基線(xiàn)水平的90%。在MCAO期間，CBF的下降及再灌注時(shí)CBF的恢復(fù)，兩組之間沒(méi)有明顯差異。

2.2MDA，NO及抗氧化酶的檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，I/R組的MDA水平明顯增加(P<0.001)，I/R-頭孢三嗪組的MDA水平明顯低于I/R組(P<0.05)。三組之間NO濃度無(wú)明顯差異。與對(duì)照組相比，I/R組SOD水平明顯降低，I/R-頭孢三嗪組SOD水平明顯高于I/R組。I/R組GSH-Px水平顯著下降，I/R-頭孢三嗪組GSH-Px水平高于I/R組。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織MDA、NO的濃度及SOD、GSH-Px的活性比較

2.3神經(jīng)功能評(píng)分 局灶性腦缺血處理后24 h，兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯下降，但與I/R組相比，MCAO后24、48 h，I/R-頭孢三嗪組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分下降的程度明顯較低。MCAO后7 d，I/R-頭孢三嗪組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分比I/R組高。見(jiàn)表2。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)比較(兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析)，三組間具有顯著性差異，提示三組的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分總體上不同。時(shí)點(diǎn)間也具有顯著性差異，提示各時(shí)點(diǎn)間大鼠神經(jīng)功能評(píng)分有較大變化。組別和時(shí)點(diǎn)的交互作用也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三組的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分變化時(shí)間趨勢(shì)有較大不同。該統(tǒng)計(jì)結(jié)論佐證了上面的分析。

2.4腦梗死病灶體積 I/R-頭孢三嗪組(10只)的梗死體積〔(185±53)mm3〕明顯小于I/R組〔7只，I/R組在接受MCAO處理后24 h內(nèi)有3只死亡，梗死體積(271±45)mm3〕(t=3.49,P=0.003)。

2.5死亡率 I/R-頭孢三嗪組的死亡率(0)明顯低于I/R組(30%)。

表2 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較

3 討 論

腦卒中是引起成人死亡及殘疾的第三大疾病〔7〕，目前治療方法多限于血管再通或預(yù)防。很多研究指出，腦缺血發(fā)生時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞的損傷是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，這為治療干預(yù)及盡量挽救組織提供了幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間窗。由于在腦卒中急性期，腦組織神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)明顯下降〔8〕，很多研究致力于尋找能夠緩解缺血后腦組織損傷的外源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)。最終，很多不同的物質(zhì)被指出在動(dòng)物研究中能夠改善腦缺血后的神經(jīng)功能損傷情況，但是這些物質(zhì)在臨床上都未被證明有效〔9〕，而且這些物質(zhì)均不能夠減少腦卒中急性期的死亡率。本研究從檢測(cè)組織氧化及抗氧化物質(zhì)水平的改變，病灶體積，神經(jīng)功能評(píng)分等方面表明頭孢三嗪對(duì)急性缺血/再灌注腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

目前主要有兩個(gè)學(xué)說(shuō)解釋缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。一個(gè)是神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為興奮性毒性氨基酸的在大腦急性缺血期對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷有重要作用；一個(gè)是自由基學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)主要解釋的是再灌注時(shí)腦組織內(nèi)發(fā)生的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ROS對(duì)磷脂的過(guò)氧化作用最終改變了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。這些事件的發(fā)生為解釋缺血/再灌注后延遲的神經(jīng)細(xì)胞死亡提供理論基礎(chǔ)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明內(nèi)皮黏附多形核白細(xì)胞，能夠產(chǎn)生ROS及RNS，參與了缺血/再灌注的腦損傷。內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子的消耗與脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成(如MDA)之間的平衡，決定了組織對(duì)氧化性損傷的抵抗力。SOD及GSH-Px是內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，能夠保護(hù)組織免受氧化損傷。因此腦組織抗氧化物質(zhì)活性增強(qiáng)，對(duì)于缺血/再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)有重要的積極作用。

據(jù)報(bào)道，頭孢三嗪在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有神經(jīng)保護(hù)作用，如肌萎縮側(cè)索硬化，多發(fā)性硬化，腦卒中，亨廷頓病等〔3，10〕。潛在的作用機(jī)制可能是提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的活性，增加神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸的攝入〔3〕。除了以調(diào)節(jié)谷氨酸代謝為基礎(chǔ)的神經(jīng)保護(hù)作用，還有研究發(fā)現(xiàn)β內(nèi)酰胺類(lèi)物質(zhì)能夠抑制次氯酸的氧化作用。還有研究發(fā)現(xiàn)給腦缺血的動(dòng)物頭孢三嗪后，一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，BDNF，NT3及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體，TrkB，在皮質(zhì)梗死區(qū)周?chē)鷧^(qū)域均有增加。眾所周知，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠通過(guò)減少細(xì)胞凋亡提高細(xì)胞的存活率〔11〕。

在腦缺血的動(dòng)物模型中，MDA水平上升。本研究中，I/R-頭孢三嗪組大鼠在接受頭孢三嗪注射后，MDA水平下降提示頭孢三嗪能夠緩解脂質(zhì)過(guò)氧化作用。在缺血的環(huán)境中，SOD形成了對(duì)抗再灌注時(shí)過(guò)度活性O(shè)2產(chǎn)生的主要防御系統(tǒng)。本研究結(jié)果表明在缺血發(fā)生后，頭孢三嗪能夠增加腦組織中SOD的水平，實(shí)現(xiàn)其抗氧化、神經(jīng)保護(hù)作用。GSH是一種最重要的胞內(nèi)非蛋白-巰基供給物質(zhì)，在清掃自由基方面有重要的作用。本研究中，缺血/再灌注后GSH的水平輕度下降，這與其他的研究〔12〕結(jié)果一致。

本研究的結(jié)果提示頭孢三嗪能夠降低腦缺血/再灌注后大鼠的死亡率，改善神經(jīng)功能缺損，而未伴隨梗死體積的減小。曾有研究指出，MRI評(píng)估得到的腦梗死體積與大鼠神經(jīng)功能缺損無(wú)相關(guān)性。而且有的研究指出盡管T2W-MRI評(píng)估發(fā)現(xiàn)梗死體積并未下降，但頭孢三嗪能夠顯著增加缺血半暗帶處的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目〔13〕?？梢詮膬蓚€(gè)方面解釋為什么半暗帶存活神經(jīng)元數(shù)目增加并不造成梗死體積的減?。篢2WI-MRI在腦缺血發(fā)生后48 h僅反映的是水腫區(qū)，而不是真正的壞死區(qū)域；存活的神經(jīng)細(xì)胞均勻分布于半暗帶中，在邊緣區(qū)并沒(méi)有增多，因此不會(huì)造成MRI梗死灶縮小。

綜上，頭孢三嗪的抗氧化能力使其有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減少M(fèi)DA的過(guò)度產(chǎn)生，增加腦組織中的抗氧化物質(zhì)，包括SOD及GSH-Px，并能夠改善大鼠神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度，降低大鼠死亡率。但是，頭孢三嗪的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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